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(無題) 削除/引用 No.2567-10 - 2009/01/06 (火) 01:51:56 - おお >[Re:9] ajiさんは書きました : > Invitrogenの........................ 細かい情報ありがとうございました。そういうのはたいへん助かります。 実際水溶性タンパクを扱っていまして(状況によってかなりアグリやすいのですが) 、いろいろ考えたあげく かなり改変してやってみましたところ全然でした。 まあこれは絶対にこの方法と考えてませんので、これから時間が あるときに試していこうとおもいます。 CNPAGEのほうは、文献でいろいろなタンパクを流したののを みたのですが、どうもデタージェント(DOC)の結合は水溶性 のとき特にタンパク間で結合する量に差がるようで、CBBを使う のがいいという気がしています。 進展や新たな疑問が出てきた時にまた書き込むかもしれません。 その時また、からかい程度でもコメントいただければと思います。

(無題) 削除/引用 No.2567-9 - 2009/01/03 (土) 08:23:17 - aji Invitrogenの英語版UsersManualをお持ちでしょうか？どこからダウンロードしたのか忘れましたが、Invitrogenのどこかにあります。 こちらにバッファー組成が載っていますが、BisTris系です。確かにアノード、カソードバッファーを同じにして、うまくやったもんだ、と感心しました。 ところが、実際にこのレシピ通り作るとInvitrogenが売っているバッファーよりも低分子量領域のバンドが太くなる傾向があります。なので買ったものを使っています。 あべちゃんさんのお示しになった論文、 Wittig, Karas and Schagger, 2007, Mol. Cell. Proteomics 6, 1215-25 のhrCNEをInitrogenのバッファーにカソードに界面活性剤の添加のみで使って見ましたが、使えました。 余談ですが、当方のサンプルではSample Bufferはレシピ通りのNaCl入りだと分離がいまいちで、初期の論文のレシピ（Nat Protocolにも載ってます）を使った方がバンドが綺麗だったことが多いです。ところが、サンプルの事情でTrisそのまま使ったこともありますが、問題ありませんでした。Sample Bufferは買ったことありません。ポンソーだけ入れてます。

(無題) 削除/引用 No.2567-8 - 2008/12/27 (土) 15:57:03 - おお >[Re:7] BNさんは書きました : > Shagger (2001) Methods Cell Biol. 65, 231-244 > に、バッファーシステムをbis-Tris系からimidazole系に変更した理由が書かれています。 > > 理由は、bis-TrisがLowry法をはじめとする多くのタンパク定量法に影響を与えるからだそうです。 ありがとうございました。 Nature protocols にも何かそのようなことががかれてました。

(無題) 削除/引用 No.2567-7 - 2008/12/27 (土) 13:08:55 - BN Shagger (2001) Methods Cell Biol. 65, 231-244 に、バッファーシステムをbis-Tris系からimidazole系に変更した理由が書かれています。 理由は、bis-TrisがLowry法をはじめとする多くのタンパク定量法に影響を与えるからだそうです。

(無題) 削除/引用 No.2567-6 - 2008/12/26 (金) 14:12:48 - おお >[Re:5] あべちゃんさんは書きました : コメントをいただき心強いです。 そう考えるのが妥当だなというところに 考えがまとまってきています。

(無題) 削除/引用 No.2567-5 - 2008/12/26 (金) 14:03:56 - あべちゃん ゲルはBisTris and 6-aminohexanoic acidで良いです。 これは結果論です。 おおさんが示されたように Schagger et al, 1994, anal biochem. 217, 220-230 Schagger and von Jagow, 1991, Anal. Biochem, 199, 223-31 Schagger and von Jagow, 1987, Anal. Biochem. 166, 368-79 では、ゲルも泳動バッファーも、BisTris系です。 ですが、 Wittig, Karas and Schagger, 2007, Mol. Cell. Proteomics 6, 1215-25 （これはよくまとまっている論文だと思います） では、バッファーはイミダゾールとTricineになります。 ゲルはref.が貼ってあって、 Wittig, Braun and Schagger, 2006, Nat. Protocol, 1, 416-28 に書いてあるそうですが、購入も認められず、著者にもらおうと連絡を取りましたが、結局入手できずじまいです。 なので、実はBisTris系かは、わからなかったのです。 しかし、ためしに、昔のSchagger先生らの論文にあるゲル組成で実験してみるとうまくいったので、そのままそれを継続している始末です。 ちなみに、invitrogen Native ゲルでも、イミダゾール Tricine系泳動バッファーでうまくいきます。というか、最近は、バッファーは自前で作り、ゲルだけ購入しています。

(無題) 削除/引用 No.2567-4 - 2008/12/26 (金) 12:20:40 - おお >[Re:2] あべちゃんさんは書きました : ありがとうございます。 > アノードはイミダゾール/HCl > カソードはイミダゾール、TricineにCBBやDDMあるいはDOCやTween-20などを加えます。 > で、ゲルはBISTRIS-aminocaproic acidですよね、、、、 でインビトロジェンのは、両極一緒、、、 まてよ、陰極よう添加物も売ってたから、 それを混ぜれば陰極用になるのか、、、、 そうするとアノードはイミダゾールかBISTRISでpH7 カソードはそれにTRICINEが加わることになって、pHは7でない ことになるのか、、、イミダゾール(orBISTRIS)/TRICINEの状態で pH7にすると全然違うバッファーになってしまうということでしょうか。 もう一度プロダクトマニュアルさがそ、、、 一様見れるものは見たつもりだけど、見落してんだろうな、、、 シェーカーっでTRICINEの電気えいどうをかいはつした人なんですね。

(無題) 削除/引用 No.2567-3 - 2008/12/26 (金) 12:06:05 - おお >[Re:1] おおさんは書きました : > で、さらに混乱しているのはNativePAGE™ Novex® Bis-Tris Gelと > NuPAGE® Novex® Bis-Tris Gelは別物ですよね。 あ、やっぱり文字化けしている。 で、さらに混乱しているのはNativePAGE Novex Bis-Tris Gelと NuPAGE Novex Bis-Tris Gelは別物ですよね。

(無題) 削除/引用 No.2567-2 - 2008/12/26 (金) 12:02:15 - あべちゃん invitrogenのバッファー カソードにはCBBを入れますよね。 そこにTricineが入っているんですよ。 invitrogenのは基本的にWittigさんとハーマン・シェーカー先生のところの方法だとおもいます。 僕はシェーカー先生の論文を元にネイティブPAGE (BN-PAGE, CN-PAGE)をやっていますが、 このシェーカー先生のところでは、現在、イミダゾールを加えた方法がスタンダードだと思います。 つまり アノードはイミダゾール/HCl カソードはイミダゾール、TricineにCBBやDDMあるいはDOCやTween-20などを加えます。 大元のBisTrisの方法はわかりません。

BN-PAGE/Native-PAGE 削除/引用 No.2567-1 - 2008/12/26 (金) 11:46:30 - おお なんだかよく分からなくなっています。 BN-PAGEオリジナルを読みながら、方法を調べているのですが、 オリジナルはCathode buffer Tricin/Bistris buffer Anode Bistris bufferです。 インビロジェンのBN-PAGEの紹介をしているチラシに はBISTRISの代わりにイミダゾールを加えた方法 を紹介しています。 http://www.invitrogen.co.jp/electro/BN-PAGE.pdf インビトロジェンホームページで探っていくとBN-PAGEのバッファーを 売っているようですが、これは陰極と陽極同じバッファーのようです。 http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&productID=BN2001 で、さらに混乱しているのはNativePAGE™ Novex® Bis-Tris Gelと NuPAGE® Novex® Bis-Tris Gelは別物ですよね。

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