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(無題) 削除/引用 No.2566-9 - 2008/12/31 (水) 17:10:18 - おお >[Re:8] すけさんさんは書きました : > カラムが一本２００円前後するようですので、まずはエタ沈で > 試してみたいと思います。（自作で作るとすると、空カラムは安く入手できるのでしょうか？） わたしは、水で膨潤させたG50を単なる0.2ミクロンのエッペン型フィルターに 500ulほどのせて使ってます。 さいきんGEでRNA精製用きっとを買うと、組織を破摧した時に残る、比較的 大きなデブリスなどの組織片を除くプレフィルターがついてくるのですが、 細胞では必要がないので、それを取っておいて必要な時にG50を載っけてます。 200円ぐらいですか、、、そんなたかかったかなあ、、、でも そうかもしれない。 > おおさんの尿素とエタ沈に関する情報はとても勉強になりました。 これは個人的な感触であまり学術的根拠がありません。 余裕のあるサンプルとかで、まずはお試しください。 > > グラスミルク、収量が５割くらい、かつ、たまに取れなかったり、というイメージがあるのですが実際のところどうなのでしょう？　シリカ系のカラム精製キットが主流なのは、そこらへんに原因があったからなのでしょうか。 グラスミルクもしリか系カラムも原理は同じなんですが、、、 たしょう改良はされていると思いますが、、、 グラスミルクはDNA溶液にガラスの微粒子みたいなのが 残ったりするせいか、クリアーな溶液が得られなかったような 記憶があります。

(無題) 削除/引用 No.2566-8 - 2008/12/31 (水) 16:23:46 - すけさん genjiさん、 APさん、 おおさん、 丁寧に回答していただいてありがとうございました。 使ったことがないのですが、スピンカラムも使い勝手が良さそうですね。 カラムが一本２００円前後するようですので、まずはエタ沈で 試してみたいと思います。（自作で作るとすると、空カラムは安く入手できるのでしょうか？） おおさんの尿素とエタ沈に関する情報はとても勉強になりました。 グラスミルク、収量が５割くらい、かつ、たまに取れなかったり、というイメージがあるのですが実際のところどうなのでしょう？　シリカ系のカラム精製キットが主流なのは、そこらへんに原因があったからなのでしょうか。 話題が横にそれてしまいましたので、とりあえず継続させてください。

(無題) 削除/引用 No.2566-7 - 2008/12/27 (土) 18:43:08 - おお 一般に精製用に使われるカラムはgenjiさまがおっしゃっている グラスミルク(要するにガラスの破片で、シリカともいう) とほぼ同じ素材を使ってます。 一度ここでその方法で尿素を組み合わせると効率が悪くなった というのを聞いたことがあります(方法をすべてフォローしてないので 断言できないのですが)ちょっと勧めるのは気が進まないです、 尿素存在下でエタチンはしょっちゅうやってます。 どのクラい尿素が残るかはデーターがあるわけでは ないのですが、下流の反応で問題が起こったことは ありません。逆に案外というか可也きれいになります (といっても、感触だけですが)。汚くってマンマルの 細胞に毒性をしめすプラスミドが、毒性を示さなく なったりとか。6M尿素存在下で3M酢酸ナトリウム 10-15%(pH5くらいのやつ)加え、等量のイソプロパノールで 温度は何も考えず室温で遠心してます。 糖質がきになったのですが、これは 落ちてきても、邪魔しないかといま思い直している ところです。 AP様のGー25/50とかのスピンカラムもいい案だと思いますよ。 こっちのほうがステップ少ないし。

(無題) 削除/引用 No.2566-6 - 2008/12/27 (土) 13:16:43 - AP DNAの濃度と尿素（ほかに入っていればSDS）の濃度の兼ね合いが問題ですが、 PCR反応に十分なDNA濃度を保ったまま（これはゲノムDNAのような複雑性が高いものか、PCR産物のようなコピー数が多いものかによって違ってきますが）、尿素の濃度が十分に低くなるようになるならば、希釈して使うのでいいと思います。PCRですからかなり希釈して使えるし、多少の不純物はほとんど結果に影響しないでしょう。 EtOH pptは簡単でコストもかからないし、ローディングバッファに含まれる物質は確実に取り除けると思います。ただし、EtOHに対する尿素の溶解度は水の場合の1/10-1/20くらいなので、条件によっては沈殿するかもしれません。EtOH沈殿では70%前後のEtOHなので、どのくらい影響するかわかりませんが、室温で処理し、Rinseを念入りにした方がよさそうです。 この場合、私ならスピンカラムでゲルろ過することを考えます(GEのmicrospinや類似品、あるは自作）。カラムにかけて遠心してflow-thruを取るだけなので、樹脂に吸着させる方式より簡単です。

(無題) 削除/引用 No.2566-5 - 2008/12/26 (金) 19:14:09 - genji ガラスパウダーは便利で素早く綺麗にDNAを回収できます。 GeneClean Kitとか、EasyTRAPとか。 私は結構重宝しています。 http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?catcd=B1000354&subcatcd=B1000355&unitid=U100003436

(無題) 削除/引用 No.2566-4 - 2008/12/26 (金) 18:13:18 - すけさん ＜おおさん、中年さん コメントありがとうございます。 希釈、及び、エタ沈は確かに簡単で良さそうですね。 ちなみに密度はsucroseを使っています。 下流のアプリケーションがPCR、シークエンスなのですが、産物が3Kbと長く収量も稼ぎたいので、なるべく綺麗にしておきたいという思惑もあったりしました。

(無題) 削除/引用 No.2566-3 - 2008/12/26 (金) 14:04:46 - おお エタチンで回収できると思います。クロロフォルムを一回やれば 色素はその時ある程度除けると思いますが、エタチンの時 アルコールにかなり行くと思いますし、、、 ローテディングバッファーはグリセロールですか? シュークロースですか? 糖質がおおいと、一緒に落ちてくるかもしれないので、、 少し薄めた方がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2566-2 - 2008/12/26 (金) 12:42:08 - 中年 PCRならそのままを1/10程度に希釈すれば使えませんか。

核酸泳動用ローディングバッファーからのDNAの回収 削除/引用 No.2566-1 - 2008/12/26 (金) 11:38:25 - すけさん DNA電気泳動用のローディングバッファーを添加したサンプルから DNAを回収するにはどうしたらよいでしょう？ 第一選択肢としてキアゲンのカラムを考えていますが、妥当な判断でしょうか？ バッファーの組成は一般的なもので、ショ糖、BPB、尿素が入っています。 用途はPCRですが、大量のサンプルがあるので、できるだけ回収率、精製度にばらつきがないと、結果の再現性が高くなると考えています。 経験者のコメントをいただけると無駄な実験をしなくてすみますので助かります。

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