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(無題) 削除/引用 No.2564-17 - 2008/12/26 (金) 14:50:46 - 中年 APさんの仰るような実際的な意味合いはもちろんありますが、F'因子を持たない株でもシングルコロニーからスタートすることが、教科書的な作法としては勧められていると思います。 シングルコロニーからスタートするというのは、微生物を扱う上での鉄則みたいなものです。前回の培養の途中で生じたかも知れない変異体が、今回の培養でさらに増えてしまうことのリスクを回避するためだと理解しています。専らプラスミドの構築や増幅に使うための宿主株なら、直接液培に植え継いでも実際上はめったなことはないとは思いますが、いずれにしても大した手間ではないのでリスクは回避したいですよね。

(無題) 削除/引用 No.2564-16 - 2008/12/26 (金) 13:49:56 - AP >何故プレートに撒かずそのまま増やしてコンピテント化してはいけないのですか？ プレートでシングルコロニーを拾うのは、F'因子を保持したクローンを選択するというのが主要な目的です。そのためにM9最少培地プレートや、宿主の種類によっては薬剤プレート（XL1-Blueならtetracyclin、など）で選択します。 薬剤の入っていない通常培地のプレートに開いてもあまり意味がないと思います。 多くの宿主・ベクター系では、宿主にF'因子が保持されている必要があります。 F'因子に系に必要な遺伝子、例えば青白セレクションに必要なlacZ遺伝子の一部、lacZのレプレッサーでIPTG誘導に必要なlacIや、M13系ファージの感染に必要なF線毛の遺伝子が乗っていたりするからです。 F'因子は培養をしているうちに落ちます。植え継ぎ植え継ぎで培養を繰り返すとその頻度も高くなります。F'因子が抜けたクローンでは、本来は青くなるべき非組換えプラスミドの形質転換体でも青くならなかったり、融合タンパク質発現系で、誘導をかけなくてもタンパク質が発現してしまって増殖ができなくなったり、いろいろ不都合があります。

(無題) 削除/引用 No.2564-15 - 2008/12/26 (金) 11:48:56 - コンピ初心 IRES様 横から便乗失礼します。コンピを作りたい初心者です ＞シングルコロニーをアイソレート これはどうしてですか？ 何故プレートに撒かずそのまま増やしてコンピテント化してはいけないのですか？ 理由が分からないので教えていただければと存じます。

(無題) 削除/引用 No.2564-14 - 2008/12/26 (金) 11:24:29 - 松田バカボン ありがとうございます！ とても参考になりました。 生物学的な表現がちゃんとできていなくて申し訳 ございませんでした。 今後の参考にさせて頂きます。

(無題) 削除/引用 No.2564-13 - 2008/12/26 (金) 11:12:52 - ＩＲＥＳ 誤解をされる可能性があるので指摘しますが 市販のコンピテントセルを増やしてそのままトランスフォームしてもだめですよ。市販のコンピテンとセルを抗生剤無しのプレートに撒いて、シングルコロニーをアイソレート、コンピテント化してからでないとダメですよ。

(無題) 削除/引用 No.2564-12 - 2008/12/26 (金) 10:12:42 - あいうえお DH5aなどのコンピとしてよくつかわれる菌株のグリストから、 自作コンピをつくるときは、やはり作り方に依存して コンピテンシーが変わると思います。私の場合は、 野島法の自分アレンジで、常に１０の８乗以上のコンピテントセルが できています。

(無題) 削除/引用 No.2564-11 - 2008/12/26 (金) 00:21:11 - DSC バカボンさん 言葉づかいがおかしいので、皆さん返答に困っておられるみたいですよ。 「コンピテントセルのグリセロールストック」っていう表現は、 「煮魚の刺身」って言ってるようなもんですよ。 「コンピテントセル用の大腸菌のグリロールストック」だったら 例えれば「煮魚用の魚の刺身」と同じ語法ですから、それほどおかしくないでしょ。 どこがおかしいのか、自分でも確認してみてください。 正しい言葉づかいを身につける努力も必要です。 あまりにも気になったので、書き込んでしまいました。

(無題) 削除/引用 No.2564-10 - 2008/12/25 (木) 21:42:00 - DNA 「コンピテント」なコンピテントセルを一箱買って、融かさずにちょっと掻き取って自作用に増やして、残りは何か困ったときなどに使えば良いんじゃないですか？

(無題) 削除/引用 No.2564-9 - 2008/12/25 (木) 18:31:18 - genji オリジナルストレインは理研バイオリソースセンターで入手可能です。 http://www.brc.riken.jp/index.shtml 私はコンピを買っています。 大量に必要な実験計画は立てませんので。

(無題) 削除/引用 No.2564-8 - 2008/12/25 (木) 18:15:07 - 松田バカボン ありがとうございます。~さんの言うとおりです。 分かり辛い説明ですみませんでした。 自分の中では、コンピテントセルのグリセロールストックから プレートにまいて、そこから大量調製して作製するものだと 思っていたので…。そっちの方が安いですし。 どうやら市販のコンピテントセルを増やして、 トランスフォーメーションに使えるみたいですね。 ちなみに、市販のコンピテントセルを大量に増やして、 グリセロールストックを作ると、遺伝子導入効率は 市販の状態を維持できるのでしょうか？作り方に よっても導入効率は変わると思いますが、さほど 効率が変わらなければ自分で作ってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.2564-7 - 2008/12/25 (木) 18:05:42 - ~ コンピテントセルを買うと高くつくので、コンピテントセルになっていないストックを購入したいということですよね。 プロメガでは、いくつかのグリセロールストックの大腸菌株を販売しています。 ただ、始めにコンピテントセルで購入して、それを増やして使っている人は多いと思います。

あの〜 削除/引用 No.2564-6 - 2008/12/25 (木) 17:53:22 - ザンギ DH5αとかJM109とかその他いろいろなコンピテントセルが売られていますね。 コンピテントセルという言葉は、「コンピテンシーを与えられた状態のセル」あるいは「コンピテンシーを獲得できるような処理を施してあるセル」という意味です。 おっしゃりたいのはストレインとか株とか菌株という意味でしょう。 正統な入手経路をお探しでしたらATCCでしょうね。 NEBだったか何処かのメーカーは、制限酵素等の冷凍商品を買うとリクエストに応じて一般的な株なら分けてくれたと思います。どこだったか正確には思い出せませんし、もうやめちゃったかもしれません。 その他、商品として開発された菌株もあるので、そういう株についてはそのメーカーからコンピテントセルの状態のものを購入することになると思います。 DH5αとかどこにでもあるような知財とかMTAのうるさくない株なら知り合いから貰うのが普通だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2564-5 - 2008/12/25 (木) 17:51:32 - R 質問の意図がよく分かりませんが。 >すぐに使えるコンピテントセル から >少量とってプレートにまいて増やして すればいいのでは・・・。

(無題) 削除/引用 No.2564-4 - 2008/12/25 (木) 17:49:02 - あいうえお ヒートショック用のコンピからは、 抗生物質なしのLBプレートに撒いて、 自作コンピできますよ。 とりあえずシングルコロニーを何個かひろって 自分でグリストつくってみては？

(無題) 削除/引用 No.2564-3 - 2008/12/25 (木) 17:38:16 - 松田バカボン 説明不足でごめんなさい。 実験にすぐ使えるというのは、チューブに100μl単位で 入ってて、エレクトロポレーションやヒートショックに すぐ使える状態のコンピテントセルのことです。 そうでなく、グリセロールに入った状態のコンピテントセルで、 そこから少量とってプレートにまいて増やして、自分のラボで 作製したいと考えています。 そもそも、グリセロールに入った状態のコンピテントセルって 販売されているのでしょうか？ みなさんは、どこのメーカーからコンピテントセルを購入 しているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2564-2 - 2008/12/25 (木) 16:59:02 - 中年 何を求めておられるのかよく分かりません。コンピテントセルとはすぐに実験に使えるものを言いますが。

コンピテントセルの購入 削除/引用 No.2564-1 - 2008/12/25 (木) 16:55:58 - 松田バカボン 質問です。 みなさんは、グリセロールストックのコンピテントセルを どのメーカーから購入していますか？ ラボで作製できるような、グリセロールストックの コンピテントセルを探してるのですが、すぐに実験に使える ようなコンピテントセルしか売られていないように思いました。 どこのメーカーからグリセロールストックのコンピテントセル を購入できるか教えて下さい。

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