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精巣切片 トピック削除
No.2563-TOPIC - 2008/12/25 (木) 16:17:50 - 400
はじめまして。
現在、マウス精巣を用いてRNA回収（trizol）と、パラフィン切片（H.E染色）を作成しています。
いままではRNAとパラフィンは別個体で行っていたのですが、個体間の差が大きいため同一個体で行いたいと考えています。
精巣をメスで切ると精細管が飛び出して構造が崩れて切片の評価ができなくなってしまいます。
そこで精巣を液体窒素で凍らせてメスで切り、RNAと凍結切片で行おうと考えています。しかし精巣を凍らせた場合、RNAの質が落ちるのではないかと心配しています。
できれば室温で精巣を放置させ少し硬化してからメスで切るか、メスのみを冷やして（ディープ）切ればうまく切れればRNAの質の心配もなくなると考えているのですが、どなたか精巣の構造を崩さずに切れる方法等、その他の方法等があれば教えていただけないでしょうか？
　
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(無題) 削除/引用
No.2563-6 - 2008/12/29 (月) 20:52:42 - 400
~さんへ

おっしゃられているように、実験する上で、動物を使用するので無計画ではできませんが、事情によりクリオスタットを使用できるのが年明けの2週以降となってしまうのです。
しかしサンプルはどんどんその前にたまっていくので、その前にドライアイス・エタノールか液体窒素どちらがいいのかを実際に確認する手段がないのでご教授いただけたらなと考えて質問しました。
今できることとして他の実験で使用しない精巣を使い、凍結後に即4%PFA+0.1％GA、ブアン固定液にて固定しパラフィン切片としてH.Eで構造を確認しました。
しかし予想どおり間質がスカスカで、一度凍らせた事で通常のパラフィン切片での構造と雲泥の差がでました。
精巣の凍結切片を使用し、どの程度の品質の切片ができるのかを載せてある文献やWebがありましたら教えていただけないでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.2563-5 - 2008/12/28 (日) 09:13:43 - ~
すでに目的を満たす方法ができたのであれば、
それ以上の系の開発はやる必要がないと思いますけど。
大学であれば、液体窒素のほうが、ドライアイスよりも入手しやすいでしょうし。

まだ切片は作っていないのでしょうか。
そうであれば、未固定の凍結サンプルを、いかにうまく目的の構造を残してスライスするかの検討を行う際に、
２種類の凍結を行った精巣を用意してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.2563-4 - 2008/12/28 (日) 00:31:39 - 400
~様へ

早速のお返事ありがとうございました。
RNAの質の問題がないとのことでしたので、今日凍結後にメスにて切断した精巣にTRIzolを入れすぐホモジナイズしてtotalRNAを回収しました。
DNase後の純度がいつもは1.95〜2.0でしたが、今回は1.88〜1.92でした。
少し落ちはしたものの十分な結果が出ました。

立て続けに質問で申し訳ないのですが、今回は液体窒素に精巣を突っ込んで凍結させたのですが、ドライアイス・エタノールとどちらがいいのかな？と疑問に思いました。
液体窒素と比べドライアイス・エタノールの方が緩慢な凍結となって精巣構造が崩れるのでしょうか？
ただその後ディープフリーザーで保管する事を考えるとより温度が近いドライアイス・エタノールの方が良いのかな？とも思ったりもしました。
素人的な質問なのかもしれませんが教えていただけるとありがたいです。
よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用
No.2563-3 - 2008/12/25 (木) 16:49:50 - ~
凍らせた後は凍結切片を作製すると書かれていましたね。
別に、RNA側に問題は無いと思いますので、
機器があるのでしたら、試してみてはいかがでしょうか。

ただ、溶かすときには、いきなりホモジナイザーにかけたり、
ハンマーなどで砕くなどで、速やかに溶解液と組織を混ぜ合わせる必要があるでしょう。
その点については、過去ログに詳しく書かれているはずです。

(無題) 削除/引用
No.2563-2 - 2008/12/25 (木) 16:26:43 - ~
個体差が問題であれば、
精巣は2つありますので、1個はパラフィン包埋、残りをRNA抽出に用いてはいかがでしょうか。

左右で違うというのであれば、半分に切った両側が同じであるという理由も無いと思いますが。

別に液体窒素で凍らせても、RNAの質は落ちないと思いますが、
切った後に、パラフィン包埋するときに、崩れるような気がします。
どうせ凍らせるのであれば、クリオスタットで切ってみてはいかがでしょうか。

精巣切片 削除/引用
No.2563-1 - 2008/12/25 (木) 16:17:50 - 400
はじめまして。
現在、マウス精巣を用いてRNA回収（trizol）と、パラフィン切片（H.E染色）を作成しています。
いままではRNAとパラフィンは別個体で行っていたのですが、個体間の差が大きいため同一個体で行いたいと考えています。
精巣をメスで切ると精細管が飛び出して構造が崩れて切片の評価ができなくなってしまいます。
そこで精巣を液体窒素で凍らせてメスで切り、RNAと凍結切片で行おうと考えています。しかし精巣を凍らせた場合、RNAの質が落ちるのではないかと心配しています。
できれば室温で精巣を放置させ少し硬化してからメスで切るか、メスのみを冷やして（ディープ）切ればうまく切れればRNAの質の心配もなくなると考えているのですが、どなたか精巣の構造を崩さずに切れる方法等、その他の方法等があれば教えていただけないでしょうか？
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