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DNase処理していないRNAサンプルをDNase処理したいです トピック削除
No.2558-TOPIC - 2008/12/25 (木) 07:38:28 - あおい
こんにちは。
宜しくお願いします。

カラムを用いたキットでRNA抽出（DNase処理無し）しました。
その後、そのDNase処理していないRNAサンプルをDNase処理したいのですが、どのようにするのが適切なのでしょうか・・・？

もしどなたか教えていただける方がいらっしゃれば嬉しく思います。
宜しくお願いいたします。
　
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No.2558-7 - 2009/01/03 (土) 12:42:16 - キアゲン
もし精製カラムがRNeasyであればRNeasyMiniの英文説明書71ページにDNA分解の方法が、書いてあります。ナンバー９ さんが紹介していたカラム内消化はこの説明書の69ページに書かれています。

また私はQuantiTect Rev. Transcription Kitを使っていますが、このキットでは逆転写反応直前にDNA分解ステップがあります。このキット中のDNA分解ステップにより、逆転写酵素を加えないリアルタイムPCRのCt値が15以上増加することから、大部分のゲノムDNAは分解されたと思われます。発現量の多い遺伝子をRT-PCRを行うためのDNA消化であれば、このキットは簡便なので選択肢に入れても良いかと思います。

発現解析の方法やターゲットとするRNAの量により、どの程度DNAが切断されればよいかが変化しますので、DNA消化の影響を調べる予備実験を行うことをお勧めします。

(無題) 削除/引用
No.2558-6 - 2008/12/29 (月) 05:10:39 - おお
>[Re:5] カナマイシンさんは書きました :
> ちなみに、同じトピックで上げられているMn添加は試したことがありません。
> どなたか試してみたという情報をいただけると幸いです。
> 横やりもいいところですがm(_ _)m
>

比較したことはないです。ただプロメガのバッファーには
入っていて、使うことがあります。
ただ、PCR目的でなかったりとかいうことも多いので、、、
結論が出ないわけですが、結果は良好ということで、、、

(無題) 削除/引用
No.2558-5 - 2008/12/25 (木) 10:48:02 - カナマイシン
ちなみに、同じトピックで上げられているMn添加は試したことがありません。
どなたか試してみたという情報をいただけると幸いです。
横やりもいいところですがm(_ _)m

(無題) 削除/引用
No.2558-4 - 2008/12/25 (木) 10:45:22 - カナマイシン
タカラのを使うなら↓の話題を参考にCaCl2添加をされることをおすすめします。
http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=407

このフォーラムには日々お世話になってますが、その中でも
上記トピックで伺った情報は特にためになりました。助けられてます。
ほんと、カルシウム入れないと残存するんですよねー。クロモソームDNA。

(無題) 削除/引用
No.2558-3 - 2008/12/25 (木) 10:34:45 - Pumpkin
ナンバー9様の通りでよいと思います。
DNase1を購入するとだいたい反応バッファが添付されてくると思うので、マニュアルにあった系を作って、37℃で反応させればよいと思います。

タカラので言えば、

ttp://catalog.takara-bio.co.jp/product/tech_info_detail.asp?catcd=B1000359&subcatcd=B1000378&unitid=U100003768&masterid=M100003050

となっています。

(無題) 削除/引用
No.2558-2 - 2008/12/25 (木) 10:00:17 - ナンバー９
私の場合は、ＲＮＡの濃度を測定してそれにみあった量のDNaseを加えてDNaseの説明書通りに反応を進めた後にフェノールクロロホルム抽出→エタノール沈殿しています。TaKaRaのDNaseIを使用していますが、どこのでもそれほど変わらない印象です。どれもDNAをきれいに分解してくれています。
カラムを用いたキットによるＲＮＡ抽出であるならば、DNase処理をカラム抽出と合わせて行った方が時間も短縮できるし人為的なミスも少なくなるので良いと思います。

DNase処理していないRNAサンプルをDNase処理したいです 削除/引用
No.2558-1 - 2008/12/25 (木) 07:38:28 - あおい
こんにちは。
宜しくお願いします。

カラムを用いたキットでRNA抽出（DNase処理無し）しました。
その後、そのDNase処理していないRNAサンプルをDNase処理したいのですが、どのようにするのが適切なのでしょうか・・・？

もしどなたか教えていただける方がいらっしゃれば嬉しく思います。
宜しくお願いいたします。
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