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肝臓系の細胞 削除/引用 No.2555-13 - 2009/05/15 (金) 10:07:42 - OK ヒトの肝癌由来のHepG2とマウスの肝癌由来の細胞hepa1-6をつかって、G418などの最低有効濃度の検討を行いましたが、通常の１０倍から２０倍の量を入れないと濃縮できません。 もともと肝臓という細胞が、そういう薬剤に対して耐性を持っているのではないかな？と考えています。

(無題) 削除/引用 No.2555-12 - 2008/12/25 (木) 16:08:57 - HepG2初心者 皆様 色々な情報、ありがとうございました。 G418濃度をさらに上にふってみると同時にFBSの濃度を下げてG418の感受性をあげてやる工夫をしようと思います。

(無題) 削除/引用 No.2555-11 - 2008/12/25 (木) 08:34:58 - 参考までに http://www.roche-biochem.jp/biochemica/bionews_files/no_103/r_103_4.html

(無題) 削除/引用 No.2555-10 - 2008/12/24 (水) 19:58:03 - あべちゃん １５−２５ｍMでHepesを加えてるのもいいでしょう。 HepG2に関して言えば、オレンジ色までpHが下がっても、すくすく生育しますが。

(無題) 削除/引用 No.2555-9 - 2008/12/24 (水) 19:12:34 - りょう 横から失礼。 あまりに高濃度で添加する場合はHEPESあたりを添加しておくべきでは。 参考まで。

(無題) 削除/引用 No.2555-8 - 2008/12/24 (水) 19:03:59 - あべちゃん いいえ、pH調整はしていません。 培地の色もオレンジ色をしています。 （DMEM)

(無題) 削除/引用 No.2555-7 - 2008/12/24 (水) 17:30:44 - HepG2初心者 あべちゃんさん コメント、ありがとうございました。 4000 ug/mLとはかなり濃いですね。 この場合、G418を培地に加えた後、pHは調整しましたか？

(無題) 削除/引用 No.2555-6 - 2008/12/24 (水) 16:36:04 - あべちゃん 私もATCCから入手したHepG2を使って実験しています。 4,000 ug/mLで10日です。 （7日目くらいで全滅していますが、不安なので） おおさんがおっしゃるようにHepG2は、粘り強いです。 puromycin や hygromycinも、一般的に使われている濃度の4，5倍くらい加えて選択しています。

(無題) 削除/引用 No.2555-5 - 2008/12/24 (水) 15:38:28 - HepG2初心者 おおさん、ありがとうございます。 FBSの濃度を下げて増殖能を落としてやるのは、セレクションの際に有効かもしれませんね。 intactな細胞を使って一度試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.2555-4 - 2008/12/24 (水) 15:12:12 - おお HepG2はたしかに頑固だった気がします。1週間たっても、G418で全く動じず、ディッシュの中に細胞がパンパンになったのを、見たことがあります。確か濃度は同じくらいだったと思います。トランスフェクションの効率がいいのか、細胞が多分肝臓由来のため若干でも解毒できる作用があるのかだと思います。でも飼い続けると(多分一度はけいだいしないと行けないかもしれませんが)選択がかかると思います。選択がかかってもすでにコロニーが大きくなっている場合もあると思いますので、シングルコロニーを拾いたかったら、さらにトリプシンではがして、薄くまいてコロニーを拾わないといけないかもしれません。トランスフェクションご、そのディッシュでコンフになったら、思い切って薄くまいてもいいかもしれません。 基本的にトランスフェクションなしで薬剤にどの程度抵抗性があるか見ておくと、実際のセレクションでコントロールがしやすいと思います。 あと今思いつきましたが、血清を3-5%ぐらいに下げて増殖を抑えるとセレクションしやすいかもしれません(完全に抑えるとインテグレーションされなくなってしまいそうですが、、、)。

(無題) 削除/引用 No.2555-3 - 2008/12/24 (水) 14:41:58 - HepG2初心者 早速のコメント、ありがとうございました。 確かに細胞密度は影響がありそうです。 というのも、播種後すぐは細胞増殖は止まっているように見えるものの、少しずつ増殖して密度が濃くなると、感受性がなくなってくるように見えてました。 トランスフェクションの時はある程度の密度で培養して、その後、継代を適宜行って密度を低くするという方針で行けば、G418の濃度が800 ug/mLでも耐性コロニーの獲得が可能ということですよね。

(無題) 削除/引用 No.2555-2 - 2008/12/24 (水) 14:25:18 - み 最初にまく細胞密度にもよるのでは？ 800でstable作成経験有。 たしかに4-5日ではあまり区別つかないと思います。 別の1000でも生存するものはしますよ。 有効力価で計算されてますか？ うす〜くまいて10-14日くらいmedium交換しつつ維持すればコロニー形成するものと、増殖止まるものの区別はできます。

HepG2に遺伝子導入する時のG418濃度 削除/引用 No.2555-1 - 2008/12/24 (水) 14:08:09 - HepG2初心者 HepG2に発現ベクターを導入して安定発現株の樹立を目指しています。 そこで、まずG418の濃度を検討しているのですが、800 ug/mLの濃度でもintactなHepG2がガツン（4-5日目で全滅）と死んでくれません。 2週間培養すると多くの細胞は死んでいますが、全滅とまではいかない状態です。 またHepG2はATCCから導入したものを譲り受けたものですが、念のためG418耐性遺伝子の有無をPCRで確認しましたが、もちろん入っていませんでした（ポジコンはちゃんとバンドが得られています）。 論文を検索すると800 ug/mL以下の濃度でセレクションをかけているものもありますが、それではいささか不安です。 HepG2に発現ベクターを導入して安定発現株を取得した経験がある方がいらっしゃいましたら、その時のG418の濃度と何日目ぐらいでintactなHepG2が全滅するかを教えて頂けませんか？ よろしくお願い致します。

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