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(無題) 削除/引用 No.2552-12 - 2008/12/28 (日) 09:03:17 - mikan パソコンの調子が悪くて、 お礼が遅れてすみませんでした。 アルバ様あんしん様Ｃ様ありがとうございます。 膜を重ねるなんて、目からうろこの落ちる思いでした。 教えていただいたあっとーのホームページに隅から隅まで 目を通しました。ものすごく勉強になりました。 電気泳動の方法バッファーなども見直してみます。 もーま様そうです。危なっかしいのです。 前任の研究員の方に4回ほど電気泳動を一緒に 行って頂いて、手順を覚えただけで 仕事を受け継いだ、期間契約研究員です。 2008年でものすごく進歩したのですが、 上には『この論文みたいに結果出して』と言われるだけで 何も教えていただけません。これも修行です。 抗体濃度は本当に製品の説明書にもありませんでしたから たぶん、全血清だと思います。ブロッティングは １７０ｋＤｔのたんぱくの電気泳動をしていたので、 教えられた通りのやり方で機械的にやっていました。 上からもそう指示がありました。もっともっと 工夫できそうで、答えていただいた皆様に感謝の嵐です。 契約更新を目指していい結果をだしたいとおもいます。 皆様有難うございました。よいお年を！

ん〜 削除/引用 No.2552-11 - 2008/12/26 (金) 10:37:46 - mom-a なんだか危なっかしい…。 17kDaのタンパクを10％のゲルで流すというのが個人的には？だったのですが…ラボにたくさんあったのですね…ゲルの濃度とタンパクのサイズと移動度の関係は確認しましたか？ サイズマーカーは15kDaのタンパクのみだったのですか？いくつかのサイズが混ざったものなら、それらの位置から17kDaがどの辺に泳動されているか予想できますよね？もっとも、おおさんの言われるように「BPBより先に流れる 辺では、分解能がない」という問題がありますが。あと、泳動時にスマイリングしている（ゲルの両端が中心部よりも進み方が遅い）と、端にマーカーを流していると、中央部ではもっと先に進んでいたりします。 サンプルの残りも問題でしょうから、まずサイズマーカーなどで17kDaが真ん中あたりにくるように泳動できるのを確認してから次へ進んだ方が良いですよ？ で、ウエスタンをやっているのか！とちょいと吃驚しましたが（mikanさんの最初の質問からはウエスタンをやっているとは解らないです）「抗体濃度にも問題があると思います。」と思っているのなら、最初からそう言えばいいのに…というか、何故そう思ったのですか？どのくらいの濃度で使っているのですか？お小言みたいですが、「−４０℃保存の薄いピンクの抗体」なんてのは他の人には何のことやらわかりませんよ。 ＞お勧めのブロッティングの条件などありますか？（電気の強さと時間など。） メーカー名だけ書かれてもドライとかウェットとかありますから、返事のしようがない…。あなたのいう「がっつり」がどういう条件なのかわからないし。

(無題) 削除/引用 No.2552-10 - 2008/12/25 (木) 16:05:27 - C 分子量１５Kで１５％のゲルで流してますが、BPBよりはずっと遅く移動し、問題なく分離できます。Tris-Glycine 系においてはBPBのラインは泳動の先端と思いますのでそれを越えて先に行くというのは変な気がします。そのゲルでは分離しきれないような低分子量蛋白質はPBPのラインに濃縮されるはずです。電気泳動が正しい方法で行われていないのではないかという気がするので、ゲルバッファーやランニングバッファーの組成を再確認するしてみてください。実験書によっては単位や小数点などに間違いがある場合もあるので、いくつかの本に目を通した方がいいです。

ATTOのマニュアル 削除/引用 No.2552-9 - 2008/12/25 (木) 12:30:52 - anshin ATTOのセミドライでwesternしています。 通常は、２ｍA/cm2で1時間転写していますが、低分子の時は、30分にしたりもしてます。 http://www.atto.co.jp/kotsu_series.html に、Blottingのコツなどを詳細に記載した資料がありますので、参考になるのではないでしょうか。私も参考にしています。

(無題) 削除/引用 No.2552-8 - 2008/12/25 (木) 09:09:05 - あるば ウェスタンのバッファーにSDSが入っていると膜に保持されないタンパク質もあるようです。以前何かの実験Tipsで読みました。他にも、抗体を洗ってる最中に膜から外れていく(?)とか。 取りあえず私なら2〜3枚の膜を重ねてブロッティングしてみます。 うまくいけば、1枚目を通り抜けても2枚目か3枚目で保持されるでしょう。 個人的には、セミドライよりウェット型のブロッティング装置を好んで使っています。タンパク質サイズの上から下まで、わりと均一にブロットされるような気がしています。

(無題) 削除/引用 No.2552-7 - 2008/12/25 (木) 07:49:52 - mikan ざんぎ様ありがとうございます。 膜をとおりぬけた可能性も高いです。 がっつりブロッティングしていました。 勉強になります。そんなことがあるなんて 知りませんでした！！ お勧めのブロッティングの条件など ありますか？（電気の強さと時間など。） ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2552-6 - 2008/12/24 (水) 21:18:45 - ザンギ 目的分子の大きさや移動度がわかってるんでしたら、それがゲルの真ん中にくるころに電気泳動を止めてかまわないと思いますよ。 それから小さい分子の場合はブロッティング時間も短めにしないと、膜を通り越してしまってシグナルが出ないことがあります。

(無題) 削除/引用 No.2552-5 - 2008/12/24 (水) 16:39:21 - mikan 一点様の言う通りの条件です。びっくりです！ ラボにたくさんあったゲルを使いました。 おお様のお勧めのように、２０％のゲルを 注文しました。 mon様　目的のサイズのマーカー（１５ｋＤｔ） がゲルの一番下に来たところでとめたのですが、 なんだかうまくいかなかったのです。 抗体濃度にも問題があると思います。 全血清の抗体のようです（−４０℃保存の薄いピンクの抗体） サンプルと抗体の残りが少なくなったので、 ゲルの到着を待ってもう一度頑張ってみます。 皆様ありがとうございました。 ウエスタンの器具は バイオラドと、アットーのものがあります。 どちらでもいいよと言われています。

(無題) 削除/引用 No.2552-4 - 2008/12/24 (水) 15:32:09 - mom-a 質問内容が今ひとつ不明確なように思います。 ＞サンプルの青いラインがマーカーの示す目的の箇所に追いついていないため、 「サンプルの青」とは、サンプルバッファーに含まれるBPBの青ですか？ とすると、「マーカー」とは？サイズマーカーですか？ 「マーカーの示す目的の箇所」とは、サイズマーカーの位置ですか？「示す」ということは、色付きのサイズマーカーで、泳動中に位置が確認できるということですか？ 色つきのサイズマーカーを使っているのなら、サイズマーカーの位置を基準にサンプルの位置を考えるべきでしょう（そのためのサイズマーカーでは？） あるサイズのサイズマーカーが流れてしまっているなら同じあるいはそれ以下のサイズのサンプルも流れてしまっているでしょう。 とはいえ、小さいといっても17kDaですよね…BPBより先には行かないような条件でも分離できそうな気もします。 ゲルの濃度、バッファーの種類などの条件はどうなっていますか？

(無題) 削除/引用 No.2552-3 - 2008/12/24 (水) 11:03:58 - おお >[Re:1] mikanさんは書きました : > マーカーと一緒の速さで、小さなたんぱくは > ラインより先に流れているのでしょうか？ マーカーって先頭あたりを走るBPBのことですよね。流れます。 なので私はBPBでなくてCBBを使ってます。 でもげるの%をあげるとPBPより流れが遅くなりますので、CBB を使わなくても解決すると思いますが、、、BPBより先に流れる 辺では、分解能がないので、実際、データ-として信用性がないです。 15%かグラジエントで一番濃い部分で15%以上になっているものを 勧めます。 先に流れるといってもそんなにBPBと違いがないところに くるのが大抵だと思いますが、極端に先に流れるなら、 もしかしたら、電気えいどうが問題かもしれません。 お使いのバーファーなど、システムは何でしょうか?

(無題) 削除/引用 No.2552-2 - 2008/12/24 (水) 10:38:51 - 一点読み Tris-Glycine SDS-PAGE でgel濃度は10%ってとこでしょうか？ そんな偉そうな予想でもないですね。。。 この質問で？？？ってなっているようでしたら まず担当教官とコンタクトを取るか ラボにあるプロトコール集を読む事をお薦めします。 まぁそれに問題が有る様でしたら、取っ掛かりとして http://www.invitrogen.co.jp/catalogue/invitrogen/EC6055BOX_001.shtml

小さいたんぱくのWBでマーカーがタンパクより先に流れます。 削除/引用 No.2552-1 - 2008/12/24 (水) 09:43:58 - mikan 分子量が１７ｋDtほどの小さなたんぱくの バンドを見ようとWBをしていますが、 マーカーがサンプルの先頭のラインより どんどん先に流れてしまいます。 目的たんぱくがゲルの中ほどに来たところで 電気泳動を止めたいのですが、 サンプルの青いラインがマーカーの示す 目的の箇所に追いついていないため、 躊躇して、ゲルの一番下まで我慢して 止めたのですが、目的のたんぱくが 検出できず、もしかして、流してしまったの？ と、考えています。 サンプルバッファーとマーカーをボイルしてから 流して、今度こそゲルの中ほどで止めようと 思っていますが、見た目にはわからなくても マーカーと一緒の速さで、小さなたんぱくは ラインより先に流れているのでしょうか？ 何かよいアドバイスがあれば、よろしくお願いいたします。 目的のたんぱくはTGF-βのファミリーです。

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