全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2551-6 - 2008/12/26 (金) 14:07:28 - qq １）から４）は、試してみる順番ですね。 精製する手順は、その後で考えることになるでしょう。 抗体カラムは魅力的ですが、マイルドな溶出方法があまり期待できそうに無いので、レクチンカラムの方が現実的かなと思います。

(無題) 削除/引用 No.2551-5 - 2008/12/26 (金) 11:51:23 - EcoRI Aが精製できて(1mgぐらい)、なおかつ、時間に余裕があるなら、抗体を自作して、 抗体を固相化すれば、血清から高い収率でAを精製できることができますね。 qqさんの方針になんくせを付ける訳では有りませんが… ゲル濾過->イオン交換、よりは、イオン交換->ゲル濾過の方が… あ、いや、それもケースバイケースか…

(無題) 削除/引用 No.2551-4 - 2008/12/24 (水) 23:42:00 - qq 血清だけでもいいかもしれませんが、どこかで精製Aが必要でしょう。 精製するためには、ELISAかELISA+Westernに使えるAの抗体が必要です。 血清中のAが10ug/mlと言うことは、１L中に10mgあると言うことですよね。 標準的な精製方法で手の届く量です。最終的な収率を10%と見積もると（かなり楽観的な数字ですが）1mgとれると言うことになります。 抗体でAを定量できる条件を見つけるとして、 １）硫安分画でAの回収されるところを探す。 ２）一応、ゲルろ過を試してみる。 ３）普通のイオン交換クロマトを考える。 ４）糖鎖付加が分かっているなら、レクチンカラムを考える。 のが、まあ、普通かなと思いますが、ゲル担体を全部購入するのなら、15万円くらいはかかるかもしれません。 だから、買うのも一つの方法かなと思いますが、買ったAがfunctionalかどうかは、「大問題」ですよね。

(無題) 削除/引用 No.2551-3 - 2008/12/24 (水) 22:14:32 - ザンギ ELISAでもいいけど非特異吸着もあるし精製にもっていけないので、Bがたくさんあるのならカラムのほうがいいような気がします。 Bが膜タンパクっていうのがちょっと厭らしいですけど。 膜タンパクBを固定化したカラムを作って、血清を流してタンパクAがくっ付いてくれば第一段階クリア。 くっついたタンパクAを溶出して分離精製してCBBでシングルバンドにして、もう一度カラムにかけてくっ付けば直接結合の証明終了。 で、どうでしょうか。 抗体は補助的には使いたいけど、必要ではないですね。

(無題) 削除/引用 No.2551-2 - 2008/12/24 (水) 03:15:08 - おお 大腸菌でリコンビナントをつくるのは、タンパクによりますが、 幾らかハードルがありますね。 フォールディング、糖修飾、S-S結合など。活性を調べる 系があればベターですが、あっても出てこなかったら、 ウエスタンのポジコンぐらいにしか、使えません。 血清に大量にあるなら、それでいいのではないかと思います。 まずはそれでやってみてはどうでしょうか。 ただし、それだけでは間接的な相互作用は否定できませんね。 血清でポジなら、血清をパーシャルに精製しながら目的の タンパクのあるフラクションに活性があるかとか、 若干踏み込んだ実験が必要かもと思います。あるいは血清ポジ の段階で市販品というのもあり得ます。市販品は活性が明記されてますか? 一つ心配なのはFGFなどヘパリンとの相互作用が活性に必要(ヘパリンが コファクターとして働く)ような場合です。 細胞にリセプターを過剰発現して、まく表面にどの程度そのタンパクがついているか というのも一つの方法かと思います。

蛋白間相互作用を解析するにおいて 削除/引用 No.2551-1 - 2008/12/24 (水) 02:20:27 - ジャック お世話になります。 現在、ある分泌蛋白Aと膜蛋白Bが直接結合するのではないかという展開になりました。 どうしてもその証明にはELISAで示したいと考えています。 私どもの研究室には膜蛋白Bの組み換え体が豊富にあります。 そこで、ELISAを利用して、膜蛋白Bを固相化し、そこに分泌蛋白Aをふりかけ、その結合を抗分泌蛋白抗体にて、検出しようと考えています。 しかし、問題は（pureな膜蛋白Bは豊富に手元にあるのですが、）分泌蛋白Aは購入しなければなりません。 そこで、教授に分泌蛋白AをR＆D systemsから購入したいと伝えると50 ugで５万円前後という値段に『ちょっと待った』を頂きました。 もちろん、自分で大腸菌で組み換え体の分泌蛋白Aを作ればいいだけの話ですが、それ以外の解決方法を模索していました。 そこで、皆様にお聞きいたします。 分泌蛋白Aは血清中に10 ug/mlという高濃度で存在する蛋白です。 なので、いちいちpureな分泌蛋白Aを購入しなくても、膜蛋白Bを固相化したプレートに（pureな分泌蛋白ではなく）血清をふりかけ、（もし血清中に含まれる分泌蛋白Aが膜蛋白Bに結合するのであれば）その後、抗分泌蛋白抗体でその結合を検出すればいいのではないか？という考えにいたりました。 つまり、pureな分泌蛋白Aと抗分泌蛋白A抗体の2つを買う必要はなく、後者のやり方であれば抗分泌蛋白抗体Aだけを購入すれば、実験可能かと思います。 みなさんこのやり方どう思われますでしょうか？ もちろんネガコンとしては、プレートに膜蛋白Bを固相化してないwellをネガコンにしようと思います。 質問は、もし血清中に分泌蛋白Aが10 ug/mlという高濃度で存在しているのであれば、あえて、pureな分泌蛋白Aを購入するまでもなく、血清を代用できないか？というアイデアは（うちの教授に）受け入れられると思いますでしょうか？ どうかみなさまの経験豊富なご意見をお聞かせいただけると助かります。

全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---