全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2542-14 - 2008/12/24 (水) 19:43:23 - 名無し たしかにくっついているがその後の溶出がうまくいかないという前提で書きます。溶出につかったバッファーと蛋白質を抽出可溶化したときのbufferとはイミダゾール以外は全て同じ組成でしょうか。べつにNiカラムに限ったことではありませんが、抽出時のbufferには溶けても溶出bufferには溶けないような蛋白質ならば溶出時のバッファー交換の際に溶解性が低下して精製の際の回収率が激減するトラブルはときどき起こります。たとえば塩濃度、界面活性剤などの有無などどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2542-13 - 2008/12/24 (水) 19:42:59 - おお >[Re:9] なみさんは書きました : > このキットでは、カラムを用いません。 > 可溶化した上清を、50ml遠心チューブに入れ、 > それに直接ニッケルの精製水入り粒子を入れます > （真っ黒） 黒い粒子そのものがNiと思っているわけではないと思いますが、 念のため。 お使いのものは、鉄や酸化鉄(磁石に強く吸着するので)を(強化)アガロース や、何か化学的なポリマーでコートして、その外にNiイオンを吸着 (キレート)するケミカルを共有結合させているものだと思います。 カラムは鉄や酸化鉄は使っていませんが、(強化)アガロースなどの 支持体にNiイオンを吸着(キレート)するケミカルを共有結合させている ので原理は一緒で、カラムで起こることは、ビーズでも同様に 起こりうると考えてください。 > そしてチューブをマグネットスタンドにたてて、ニッケルを > マグネット側においやって液体を捨て、 > 10mMイミダゾールでウォッシュして、 > （この濃度だとニッケルはヒスチジンから離れないらしい） これは要注意です。一般論としてだいたい10mMなら大丈夫だろうと と言う事ですが、外れることもあると思ってください。ですから、 10mMで洗った時に、はずれてないかチェックが必要です。 これも念のため > その後500mMイミダゾールを加えてマグネットスタンドにたて、 > 原因 > 色々考えたのですが、可溶画分にはしっかりきているようなので、 > 溶出の段階かと考えています。 どこまでチェックしたかはおいといて、多分吸着したままでしょうね。 解決方法は、得られたタンパクを何に使うかによって違ってくる可能せい があります。 変性条件下でいいなら、ウレア6M入りのイミダゾール500mM溶液で溶出して 見てください。変性したくないなら、TRITON-X100 1%とかデタージェント 入りの(もし使ってないなら)イミダゾール溶液とか使えるかもしれません。 デタージェントを使うなら、ビーズに吸着させる時から入れておいた方が 無難かと思います。 このような意味で、条件とか目的とか示せる範囲で正確に書いてほしいと 前回に書いたのですが、、、、 バッファーは添付のものとか、プロダクトマニュアルの方法そのまま使って いるのでしょうか、、、 Magne-Hisはプロメガのようですね。シグマも似た商品を出しているようですが、、、 どっち何だろう、、、、

(無題) 削除/引用 No.2542-12 - 2008/12/24 (水) 17:49:35 - こうじ 日本語と意味がおかしいですね・・・ ４量体になったことで４つのタグが一つの複合体にあるため結合が強くなったか？ １つのタグ単独でちょうど強く結合できるような構造になっているか？ のウラです EDTAに関しては もともとNovagenのHis-Bind Resinのプロトコールを 色々なやつに転用しています。 50mM EDTAで保存すると防腐効果にもなってちょうど良いかなって思ってます。

(無題) 削除/引用 No.2542-11 - 2008/12/24 (水) 17:27:12 - こうじ 多量体形成することはありませんか？ 以前４量体形成するやつでは50mM EDTAでelutionかけないと出てきませんでした。 そもそも結合が強くなっているのか、 ４量体全てにタグがついているかのウラは取っていませんが それ以来、Niはカラム操作ごとに外すことにしています。

(無題) 削除/引用 No.2542-10 - 2008/12/24 (水) 16:58:33 - EcoRI 何か所々おかしな表現が見受けられますが…それはそれとして… 500 mM もイミダゾールを加えれば、普通は溶出しそうなものなのですが… 操作を通して、塩濃度や界面活性剤の濃度は変わっていませんよね？

(無題) 削除/引用 No.2542-9 - 2008/12/24 (水) 16:13:48 - なみ みなさん色々ありがとうございます。 このキットでは、カラムを用いません。 可溶化した上清を、50ml遠心チューブに入れ、 それに直接ニッケルの精製水入り粒子を入れます （真っ黒） そしてチューブをマグネットスタンドにたてて、ニッケルを マグネット側においやって液体を捨て、 10mMイミダゾールでウォッシュして、 （この濃度だとニッケルはヒスチジンから離れないらしい） その後500mMイミダゾールを加えてマグネットスタンドにたて、 壁にニッケルとイミダゾールがくっついている筈なので、 液体部分を回収し、透析します。 各段階でサンプルを確保しSDS-PAGEで確認したところ、 どうもニッケルにくっついたまま、最後の溶出ができなくなってしまったようです。 原因 色々考えたのですが、可溶画分にはしっかりきているようなので、 溶出の段階かと考えています。 いまニッケルがなくなってしまい足踏み状態です 宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2542-8 - 2008/12/24 (水) 10:50:02 - 名無し アプライしようとしているサンプル、フロースルー画分、洗いの画分（フローと洗いの両画分はそれぞれプールするのでなくて、出てきた順にフラクショネーションして取ること。プールすると希釈されて分かんなくなるから。）結合してイミダゾルで溶出された画分、SDSで溶出された画分、をWBでチェックしてどこにあるか探す。それによって対策は大きく変わってくる。

(無題) 削除/引用 No.2542-7 - 2008/12/23 (火) 14:06:07 - おお ニッケルが原因で溶出しないと考えるなら、EDTA10mMぐらいで 溶出するとニッケルが樹脂からはがれるのでサンプルが落ちてくる はずです。でも大抵はサンプルがゲルの支持体にニッケルを介さず こびりついていることが多いと思います。 参考までに

(無題) 削除/引用 No.2542-6 - 2008/12/23 (火) 13:45:11 - りょう 誤解がないように追記しておきます。 樹脂をアプライしたと言っても、少量の樹脂を、です。 僕は樹脂スラリーを5 μlをSDS-PAGEのサンプル処理をしてアプライしました。

(無題) 削除/引用 No.2542-5 - 2008/12/23 (火) 13:41:58 - りょう 確かにみなさんのおっしゃる通りですね。 もう少し、精製条件とか情報があるといいなと思いました。 ちなみに、僕もHisタグ融合タンパク質の精製には非常に苦労しました。 > ヒスチジンタグのタンパク質を、ニッケルで精製しています。 > このときニッケルの量が多すぎると最後イミダゾールで溶出できないなんていうことはありますか？ どういう確認をしているのか教えて頂けると嬉しいです。 アプライサンプル、素通り画分、溶出物をSDS-PAGEチェックしたりした上でのことなのか、とか。 あと、おおさんがおっしゃるように、ゲル内でアグると言うのは僕もそれらしいことを確認したことがありますので、可能性としてはあるかもですね。 そのときは溶出後の樹脂をそのままSDS-PAGEにアプライしてチェックしましたよ。

(無題) 削除/引用 No.2542-4 - 2008/12/22 (月) 23:19:34 - A これだといーえさんがおっしゃっているように答えるしかないですね。今のところまだ精製を行われていないですよね？おおさんがおっしゃるようにまだ精製していなくとも出来る範囲で詳しいプロトコールを載せればもっとアドバイス書き込まれるかもしれないですね。

(無題) 削除/引用 No.2542-3 - 2008/12/22 (月) 14:39:49 - おお 発現は確認されているわけですよね。 で、カラムに吸着したというエビデンスはあるわけですよね。 カラムに吸着後、カラムないであグッてしまうというのは よくあるケースとききます。ですからNiのロード量 が不適切ということを考える人はあまりないと 思います(シグマのお示しの物は使ったことがないですが)。 適切なデタージェンとなど地道にさがすとかでしょうか。 もう少しカラムを使ったときのバッファーや溶出方法など を詳しく書くと、アドバイスが得やすいとおもいますが、、 Niのロードする量は普通いじらないと思いますが、 着目点として面白いと思いました。 もしへらすなら、それもてでしょう。キャパシティーの 20ー30%乗ってけて再けんだくしてつめないと いけないかと思いますが、、、 それかNiのかわりにCoが使えるなら変えてみるという のもありかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2542-2 - 2008/12/22 (月) 14:27:53 - いーえ ありません。何故そうかはマニュアルをご覧になってください。

ヒスチジンタグのタンパク精製ができない 削除/引用 No.2542-1 - 2008/12/22 (月) 12:42:30 - なみ ヒスチジンタグのタンパク質を、ニッケルで精製しています。 具体的にはSigmaのMagne-Hisを用いているのですが、 このときニッケルの量が多すぎると最後イミダゾールで溶出できないなんていうことは ありますか？ よろしくお願い致します！

全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---