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(無題) 削除/引用 No.2537-9 - 2009/02/04 (水) 07:20:38 - 免疫屋 > Ficollは、ただそのまま使うだけです。 > 特別なことは何もしません。 比重から考えてリンパ球も肝細胞もFicoll上に来るかと思ったのでその辺りをお伺いしたかったのですが…まぁ，いいや． > コラゲナーゼを使用すると、細胞が破壊されてしまったような感じになってしまいました。 > コラゲナーゼの種類によって、（入っている酵素の違いとか？）肝臓の細胞に悪影響を与える可能性はあるんでしょうか？ 単純にコラゲナーゼ処理が長過ぎた（強すぎた）のではないでしょうか？． 肝臓に対してコラゲナーゼ処理をしたことがないので感想でしかないのですが，長過ぎるコラゲナーゼ処理は細胞にダメージを与えます．DNA漏出などは認められませんでしたか？ > あと、今ナイロン製のセルストレイナーを使用しているんですが、どのプロトコルを見ても金属メッシュと書いてあるので、金属メッシュの方がいいのかなと思っています。 > メッシュによる違いはあるんでしょうか？？ >すりつぶしてセルストレイナー→33%percoll >で取れました。 僕およびまわりのラボでのやり方ですが， 「すりつぶしてセルストレイナー」ではなく，「セルストレイナー上ですりつぶす」形を採用しています．簡便ですので以下参考までに． 具体的には，セルストレイナー上に肝臓を乗せ，シリンジの内筒にて肝臓をセルストレイナー下へ押し出す要領です．ここで金属メッシュを使う場合とセルストレイナーで代用する場合とがありますが，両者ともに大した違いはありません．以前は金属メッシュに拘って使っていましたが，洗浄や滅菌が面倒ですので今はセルストレーナ−を愛用しています． ちなみに金属メッシュは確か IIDA MANUFACTURINGとかいう会社のを利用していた記憶があります（がうろ覚えですので…）． 以上，参考までに．

(無題) 削除/引用 No.2537-8 - 2009/02/03 (火) 17:03:14 - 投稿者 投稿者です。なんとか取れるようになったのでご報告を。 Nature Protocolを紹介していただき、そのプロトコルを元にしました。 確かにコラゲナーゼせず、 すりつぶしてセルストレイナー→33%percoll で取れました。 アドバイスを下さった方々に非常に感謝しています。 なんか簡単に取れたので、今までの苦労はなんだったんだろう… という感じですが。 ただ、今まで取れなかった理由が分からないので気になっています。 コラゲナーゼを使用すると、細胞が破壊されてしまったような感じになってしまいました。 コラゲナーゼの種類によって、（入っている酵素の違いとか？）肝臓の細胞に悪影響を与える可能性はあるんでしょうか？ あと、今ナイロン製のセルストレイナーを使用しているんですが、どのプロトコルを見ても金属メッシュと書いてあるので、金属メッシュの方がいいのかなと思っています。 メッシュによる違いはあるんでしょうか？？ また、金属メッシュがどこで購入できるのか、業者の方に聞いても分からない状態で。。 皆さんが使っている金属メッシュがどこのものか教えていただけるとありがたいです。

(無題) 削除/引用 No.2537-7 - 2009/02/03 (火) 15:49:54 - 横からすみません Ficollは、ただそのまま使うだけです。 特別なことは何もしません。 Percollを使う論文ばかりですが、『Ficollでも大丈夫だ』といわれて何も考えずそのままやっていました。 一度Peｒcollと比べてみます お二人とも誠に有難うございました

http:// 削除/引用 No.2537-6 - 2009/02/02 (月) 00:16:09 - TK-1 >[Re:4] 横からすみませんさんは書きました : > 横からすみません > > ＞percoll 25%/40%/80%にかければ終わりです。 > ですが、具体的にどうすればいいのでしょうか？ > 現在Ficollで分離していましたが、それではだめですか？ 15ml tubeに25% Percollを2ml、そこにsingle cell suspensionを含む4ml 40% Percollをunderlay, そこに80% Percoll 4mlをunderlayして室温で２０分遠心。lympocyteは40/80の境界にenrichされます。上の境界にはhepatocyteが分厚いペレットとしてみられます。慣れてくれば、25%の層は無しでも出来るはずです。

(無題) 削除/引用 No.2537-5 - 2009/02/01 (日) 06:43:28 - 免疫屋 横からすみませんさん 逆にお伺いしたいのですが，Ficollでどのように分離しているのか興味があります． Ficollは基本的にヒト用ですし，比重から考えても肝細胞との分離が困難な気がしますけれど． > ですが、具体的にどうすればいいのでしょうか？ TK-1さんの方法とは異なり，僕は35%Percollのみで分離していますがそれでよければ簡単に． セルストレーナーや金属メッシュで肝臓をつぶした後の遠心ペレットを35% percollでsuspendして再遠心するのみです．ペレットにリンパ球分画が来ます．お手軽なので35%一発でやってますが，ひと手間加えて80%を利用するとRBCも除去できるのかな？．強めにlysisをかけてるのでこちらではあまり問題にはしてませんが，気になる場合はそのようが良いでしょう． >[Re:4] 横からすみませんさんは書きました : > 横からすみません > > ＞percoll 25%/40%/80%にかければ終わりです。 > ですが、具体的にどうすればいいのでしょうか？ > 現在Ficollで分離していましたが、それではだめですか？

横からすみません 削除/引用 No.2537-4 - 2009/01/30 (金) 06:39:59 - 横からすみません 横からすみません ＞percoll 25%/40%/80%にかければ終わりです。 ですが、具体的にどうすればいいのでしょうか？ 現在Ficollで分離していましたが、それではだめですか？

http:// 削除/引用 No.2537-3 - 2008/12/21 (日) 07:37:11 - TK-1 collagenaseを使わなくても取れます。 還流後に100umのメッシュでつぶして、percoll 25%/40%/80%にかければ終わりです。

肝臓からのリンパ球分離法 削除/引用 No.2537-1 - 2008/12/21 (日) 05:00:25 - 初心者 非常に基本的なところなのですが、肝臓からのリンパ球（IHL）の分離がうまくいきません。 初めて肝臓を扱うので勝手が分からず悪戦苦闘しています。 プロトコルはCurret protocols in Immunology(1997)をベースにしています。今のプロトコルを簡単にいいますと １．門脈からPBSを灌流 ２．胆嚢を除き、ハサミで細かく刻む ３．コラゲナーゼ処理（〜60min) ４．セルストレイナーに通した後、ゆるく（300g)遠心 ＊このゆるく遠心したときに肝細胞がほとんど沈むと書いてあるのですが、なぜか全く沈殿しないので困っています（遠心を少し強めてもだめでした）。 ５．上清を回収し、HISTOPAQUE(SIGMA)を用いて説明書通りに密度勾配遠心分離 です。コラゲナーゼ処理なしてすりつぶしてそのままゆるく遠心するとたしかに肝細胞と思われる沈殿が見られたのですが、最終的なIHLの収率が予想の1/10以下となってしまいました。 手順の中で肝細胞が死んでその影響でリンパ球にも悪影響が出てしまったのかと思い、なるべく物理的な力がかからないように注意もしましたが、どうしてもうまくいきません。 どこがいけないのかが分からず困っています。 ちょっとしたことでもいいので、注意点や改善点を教えていただけないでしょうか。 またIHLを分離している方がいらっしゃればどのようば方法で分離しているかを教えていただけると非常にありがたいです。 初歩的な質問で恥ずかしいのですが、よろしくお願いします。

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