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(無題) 削除/引用 No.2535-12 - 2008/12/22 (月) 11:04:34 - りょう おおさん >[Re:11] おおさんは書きました : > 膜タンパクがへリックス構造で膜を貫通するとき、アミノ酸はやく20個 > ほどになります。ですので、ある領域がへリックス構造を取り、周りとの > 平均で常(20アミノ酸にわたり)に疎水性が強い場合 > 膜に貫通できると思えます。 > というのが基本的な考え方だと思います。 そうですね。 疎水性の強さは構造中のヘリックスの有無でも判断できますし。 同じタンパク質で異なる生物（私が使っている生物と近縁）の結晶構造を見ると、やけにヘリックスが偏って存在することが伺えます。 図を見て、右2/3がヘリックスが非常に目立つという感じです。 それゆえ、このタンパク質の疎水性残基は表面上に出易い傾向にある、つまりはアグリやすい傾向にあるのでは・・・と思いました。

(無題) 削除/引用 No.2535-11 - 2008/12/22 (月) 05:37:49 - おお >[Re:8] りょうさんは書きました : > おおさん > > ためになる多くのコメントありがとうございます。 > > まず、 > Hydropathy plotsでも、その部分が膜貫通していることが否定的ですか? > ちょっと興味本意ですが。 > 扱っているタンパク質のこれまでの事例から考えると、膜貫通ではないと考えていますが。 > 疎水性が高いのは十分伺えますが・・・ http://gcat.davidson.edu/rakarnik/kyte-doolittle-background.htm#ref 膜タンパクがへリックス構造で膜を貫通するとき、アミノ酸はやく20個 ほどになります。ですので、ある領域がへリックス構造を取り、周りとの 平均で常(20アミノ酸にわたり)に疎水性が強い場合 膜に貫通できると思えます。 というのが基本的な考え方だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2535-10 - 2008/12/21 (日) 20:41:03 - りょう APさん コメント、ありがとうございます。 確かに、もし獲得しようとしているタンパク質が大腸菌に毒性を示すとしたら、宿主も防御システムが働いて、発現した過剰のタンパク質をパッケージするのは当然ですね・・・ Ｎ末端にはHisタグを融合させています。 短いタグですが、この疎水性も多少ならず効いてるかもしれませんが、 基本的に、有力に作用してるのはタンパク質の疎水性のような気がします・・・ cyosolではなくpMALpのようなベクターでperiplasmに発現させると回避できるのかもしれません。 こういう方法もありですね。 しかも、MBPが融合されて、可溶性に発現されることが期待できますし。

(無題) 削除/引用 No.2535-9 - 2008/12/21 (日) 19:19:26 - AP >現在、膜タンパク質の大腸菌における発現で、完全に封入体として発現されました。 過去トピにもあったと思いますが、 一般的に膜タンパク質は大腸菌に毒性を示し、死んでしまってタンパク質がとれないことが多く、死なずにうまく発現ができたとしても、封入体になってしまうようです。逆にいうと、可溶性で発現してしまうと致死性になってしまうということではないでしょうか。 >封入体として発現される理由の１つとして、N末端側のペプチドの疎水性は結構効いているのかなと考えました。 N末端にタグを付けているのなら、融合タンパク質自体、特にN末が疎水性ということにはならないと思います。それでも、一般的に膜タンパク質の発現に困難があるのは、どこかしらに疎水性のクラスターがあるためではないでしょうか。 cyosolではなくpMALpのようなベクターでperiplasmに発現させると回避できるのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2535-8 - 2008/12/21 (日) 17:30:56 - りょう おおさん ためになる多くのコメントありがとうございます。 まず、 Hydropathy plotsでも、その部分が膜貫通していることが否定的ですか? ちょっと興味本意ですが。 とのことですが、否定的ではないんです。 しかも、その部分がＮ末端とポリペプチドのど真ん中あたりの計２箇所。 扱っているタンパク質のこれまでの事例から考えると、膜貫通ではないと考えていますが。 疎水性が高いのは十分伺えますが・・・ 「封入体はなったものはなった」ということでしょうか、難しいものです。 大腸菌でこのタンパク質を発現する際には、リーダーペプチドを欠失させたものを構築して、pETベクターにのせて、タグ未融合で発現させています。 S-S結合はおそらく３ペアーですので、そこまで多くないとは考えていましたが。

(無題) 削除/引用 No.2535-7 - 2008/12/21 (日) 16:41:19 - おお >[Re:5] りょうさんは書きました : > > このタンパク質は全体的に疎水性クラスターが分散しているんですよね・・・ > でも、Ｎ末端がその疎水性度が高いのです。 Hydropathy plotsでも、その部分が膜貫通していることが否定的ですか? ちょっと興味本意ですが。

(無題) 削除/引用 No.2535-6 - 2008/12/21 (日) 16:37:24 - おお 可溶性タンパクと言う事でお話しますと、疎水性が強い領域は アグル原因になりがちといえますが、法則性をいうのは難しいと思います。 例えば可溶性のタンパクであっても疎水性の強いところがあり、 その部分は、タンパクの内部に存在すると考えられます。 要するにフォールディングがうまく行くかどうかで、アグル 可能性も変わってきます。確かIL1はインクルージョンボディー ができ、そこからリフォールディングさせる事ができたと とおもいます。そういう物などといろいろ調べてみると いいかもしれません。 リーダーペプチドであれば、分泌されるなら分泌されたタンパクは すでにリーダーペプチドは切断されている可能性がありますので １度確認をした方がいいかもしれません。 特にその部分が疎水性がつよく、ほかのたんぱく質と結合している 場所であるなら、細胞内(生理的には)合成されて直後から、直接 ターゲットに結合しているか、シャペロニンのような役割を しているタンパクがあるかもしれません。 そういう場合はどうしても大腸菌ないでのその部分の露出は 避けれないことが多いと思いますので(GROELなどがうまく働かない かぎり)N末でなくてもあぐると思います。 細胞外のものであればS-S結合も考慮しないといけないかも しれないので大変ですね。

(無題) 削除/引用 No.2535-5 - 2008/12/21 (日) 16:04:56 - りょう おやさん 書き込む情報が足りなくてすみません。 リーダーペプチドの位置をSignalPでチェックして、 そこを考慮しないで、触媒部位のＮ末端で考えてますよ。 このタンパク質は全体的に疎水性クラスターが分散しているんですよね・・・ でも、Ｎ末端がその疎水性度が高いのです。

(無題) 削除/引用 No.2535-4 - 2008/12/21 (日) 14:46:47 - おや コラーゲンと結合してるってことは細胞外に分泌されるタンパク質なんだから、Ｎ末端の疎水性領域はリーダーペプチドでしたというオチでは？

(無題) 削除/引用 No.2535-3 - 2008/12/21 (日) 14:37:32 - りょう おおさん そうですか。 このタンパク質は膜貫通ではなく、コラーゲンか何かから構成された繊維によって膜と結合している状態で存在すると考えられているので、膜貫通ドメインではないと考えてます。 例えば、可溶化画分にタンパク質を発現したいときに、 培養条件やベクターの変更、可溶性タグの使用などが考えられるのですが、 発現するタンパク質の状態を改善するのも１つの手かなと思いまして。 たまたま検索したらN末端が疎水性が高い傾向だったので、 タンパク質のポリペプチドにおいても、特にN末端の疎水性が封入体として発現するのに効いている記憶がありまして・・・ 膜貫通ドメイン関係なく、Ｎ末端側の疎水性の高さは可溶性画分への発現を妨害するのでしょうか…？

(無題) 削除/引用 No.2535-2 - 2008/12/21 (日) 02:15:41 - おお 膜タンパクであればその可能性は高いでしょうね、 N末の疎水性のたかいところは膜貫通ドメインではないでしょうか?

大腸菌で発現させるタンパク質のN末端の疎水性 削除/引用 No.2535-1 - 2008/12/20 (土) 20:15:01 - りょう 現在、膜タンパク質の大腸菌における発現で、完全に封入体として発現されました。 このタンパク質の疎水性を検索したら、どちらかというとN末端側に疎水性クラスターが集まっている傾向にありました。 封入体として発現される理由の１つとして、N末端側のペプチドの疎水性は結構効いているのかなと考えました。 実際、どうなのでしょうか？ 皆さんのお知恵を拝借したく、書き込みしました。

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