全2件 ( 1 〜 2 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

これだけでは… 削除/引用 No.2533-2 - 2008/12/24 (水) 11:30:34 - CaP （余計なお世話ですが）年末だからでしょうか、4日経ってもコメントが付いてませんね。 何でも良い、と言うことですが、アドバイスしたくてしょうがない人たちが集まっているわけではない（と思います）ので、ああしたら・こうしたら、というアドバイスはまず出ないと思いますよ。困っている人の手助けはしたいと思いますが、質問が漠然としていては答える方も困ってしまいます。 まず第一に293にトランスフェクションした時点でGFPの蛍光は観察できますか？ できなければコンストラクトに問題がある、ということですからその線でトラブルシュートしてみてはいかがでしょう。 高効率で観察できるようであればベクタープラスミドには問題ないことが分かります。タイターが算出できる、ということはウイルスは生成されているのでしょうから、pAAV-RCとpHelper plasmidsには問題ないのでしょう（でも念のため今一度チェックされては？）し、トランスフェクションが上手く行っていないというわけでもないのでしょう。 正直AAVを作った経験はない（アデノならあります）のですが、記述されている希釈ではかなり高いMOIになると思いますが、それによる悪影響はありませんか？実際のMOIはどれくらいでしょう？ あとqRT-PCRでゲノムタイターを算出されていますが、RTをする理由は何ですか？通常のqPCRで可能だと思いますが。

アデノ随伴ウイルス(AAV)の調整について 削除/引用 No.2533-1 - 2008/12/20 (土) 15:31:25 - ゴン アデノ随伴ウイルス(AAV)の調整についてお伺いしたいと思います。 現在、AAV-EGFPを調整してHEK293細胞やマウス神経細胞に感染させていますがEGFPの蛍光が全く観察されません。 プロトコールとしては、 1. pAAV-EGFP, pAAV-RC, pHelper plasmidsをHEK293細胞(10cm plate)に各10 microgram、リン酸カルシウム法にてトランスフェクション。 2. 72時間後、細胞と培養液を回収し、Ethanol bath（-70℃）と37℃インキュベータで凍結・融解を４回行う。 3. 遠心後、上清を回収。 4. 回収したprimary viral stockを1/10,1/50,1/100に希釈し、HEK293細胞あるいはマウス神経細胞のwellにアプライ。 5. 48時間後EGFPの蛍光を観察。 AAV vectorやHEK293細胞はstratagene社から購入したためstratagene社のプロトコールに従っています。 qRT-PCR法でgenomic titerを測定すると10^11/mlです。 皆様何かお気づきの点やsuggestion、high titerのウイルスを調整する コツなど何でも良いのでコメントを頂ければ幸いです。 よろしくお願い致します。

全2件 ( 1 〜 2 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---