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ありがとうございます 削除/引用 No.2516-8 - 2009/01/05 (月) 09:37:13 - さんまま 年末年始の休み中でした。返答が遅くなりました。 ご回答ありがとうございます。 まず、洗いの問題ですが、その通りかもしれません。8wellの場合、洗いの時も200μlしか入れませんので、壁に液が残りやすい状況です。当然、バキュームするので全液吸い上げた際、真ん中が乾燥しやすい状況です。これは改善の余地がありそうです。 ＞固定しなければ染まらないのが固定するときだけ染まるという事は一般的 確かにその通りなのですが、ご質問の通り、標識ラベル抗体を生細胞に導入させる試薬＜タンパク導入試薬＞を用いて、観察しようと思っています。 ですが、もし蛍光色素が生細胞内に導入されたとしても、workしないのであれば、いくら導入できても無理な話です。この場合のworkは蛍光色素が光らない事を指します。抗体そのものの、抗原特異性は確認済みなので、大丈夫と考えています。 浮動性のターゲットであれば、流出してしまうとなれば、今回トライしているのはチューブリンなのですが、やはり重合していない分子は流出しやすいんでしょうか？またそのような重合していないチューブリン分子は綺麗な繊維状には見えないと考えられるのでしょうか？

もう一度 削除/引用 No.2516-7 - 2008/12/30 (火) 02:43:21 - pine すみません、500ulくらい、と書くつもりが。洗う途中にバッファーをすべてとって洗いのバッファーを入れる場合は、周囲はバッファーが壁にそって残っているので乾燥しにくいんですが、中央は乾燥してします事があります。このときは染色が悪くなるようです。 あと、固定すると光が強くなる、というのは固定のタイミングによると思います。染色前と後で異なる事はよくあることです。固定の方法によっても異なります。観察が終わって完全にチャンバーを乾燥させたあとに見ると今度は逆に何もかも染まっている様に強いシグナルになると思います。 しかし染色の成否を決めるのは一般に固定、固定法です。固定しなければ染まらないのが固定するときだけ染まるという事は一般的で固定方法にもよります。これはサンプルによって話が変わるのでこれといった定番はありません。ちなみに生きている細胞内のターゲットに固定なしで二次抗体を入れても染まるのですか？固定（だけでも穴があくことはある）と界面活性剤処理がないと二次抗体がworkすると思えないとおもうのですが。frozen sampleなどであればfrozen時に膜に穴ができるので固定は必要ない事もありますがそれでも浮動性のターゲットであれば固定しないと流れ出てしまう事もあります。検討はずれの答えでしたらごめんなさい。

専門ではないんですが。 削除/引用 No.2516-5 - 2008/12/30 (火) 02:23:53 - pine 専門ではないんですが、洗いが少ないのではないでしょうか？8wellはwashするバッファーの料がおそらくたぷたぷまであらっても500ug/mlくらいでしょうか。もう少し洗う必要があると思います。

たぷたぷ状態でやってみました 削除/引用 No.2516-4 - 2008/12/25 (木) 16:53:32 - さんまま well内の容量を一杯にして、標識抗体を導入してみました。 少ない通常と比較してみたのですが、ほとんど導入が確認出来ませんでした。中には一つ二つ導入できてる細胞もありましたけど。 さらにこの細胞をPFA固定してから（未染色です）見たら、とても綺麗に目的の分子（チューブリン）が綺麗に見えました。 しかし、生細胞のままで標識抗体を導入して観察しても、導入されてるとは言い難い状態です。結局、解決していません。 そこで、当初の質問からそれてしまいますが、 まず、生細胞のチューブリンの局在は微小管形成をしているのでしょうか？ 脱重合した状態のものが浮遊している状態という記述を見たことがあるのですが、はっきりしません。 ご存じでしょうか？ また固定すると、蛍光色素は増強されるものですか？ よろしくお願いします

たぷたぷは試していません 削除/引用 No.2516-3 - 2008/12/17 (水) 11:39:06 - さんまま ご返答ありがとうございます たぷたぷの状態は試していません。せいぜいwell内の半分量くらいまでやってみて効果なしでした。 確かに2ステップなので、どちらに問題があるかがはっきりしていないです。しかし、抗体の方は細胞を固定した後の染色像では、ばらつき無く、観察されているので、導入試薬に問題があるかもしれません。 １ステップでということは、標識抗体を導入試薬で入れてみると言うことですね。 まずはそれをやってみないといけないですね。 導入試薬に問題があるとなれば、最初の回答に戻ってみて、液量を十分にして処理してやってみます。本日トライするので、また結果を報告します。

(無題) 削除/引用 No.2516-2 - 2008/12/17 (水) 11:24:52 - ~ >well内の容量を変えても変化はありませんでした。 どのくらいの範囲で変えたのでしょうか？ たぷたぷの状態も試してみましたか？ 十分量が入っていないと、メニスカスで中央付近にはあまり抗体液がこない場合はありますが。 また、抗体だけでなく、 >あるタンパク導入試薬を使って の処理時に液量が少なく、中央付近にその試薬が来ていなかったかもしれません。 今回はタンパク質導入→2次抗体染色と、2回の処理を行っているために、 どちらのステップが問題なのかが分かりにくくなっていると思います。 適当な、蛍光抗体などを1ステップでタンパク質導入試薬で入れて、 そのままwashして観察するなどすれば、導入部分に問題があるかどうかは確認が取れると思いますが。

共焦点顕微鏡観察のことで 削除/引用 No.2516-1 - 2008/12/17 (水) 09:39:18 - さんまま 共焦点顕微鏡観察の時、NUNCの8wellのチャンバーを使用しています。 しかし、あるタンパク導入試薬を使って、抗体（anti-tubulin）を細胞に導入し、その後PFAで固定後にAlexa標識二次抗体で染色して観察すると、well内で染色に差が出ます。 well内の中心の細胞は淡く染色されて、角の方にある細胞だけが明瞭に見えることがあります。 この原因はなぜだかわからず、なんとか解決したいと思っています。 well内の容量を変えても変化はありませんでした。 解決方法をご存じの方、あるいは同じようなことを経験された方はいらっしゃらないでしょうか？ よろしくお願い致します。

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