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(無題) 削除/引用 No.251-5 - 2007/09/30 (日) 03:26:15 - あべ 私も全く同じ経験があります。 私の場合は、理由はわかりませんが菌株をDH5aからJM109にかえることで改善されました。菌株を変えてみるのも良いかもしれませんよ。 私のプラスミドの場合、培養時間が短く菌が十分増えていないほうがプラスミドが良く取れる傾向がありました。おそらくアンプが失活するとプラスミドを落とす（分解される？）のだろうと思います。もし他に菌株が無い場合は、培養途中でアンプを加えるのも効果ありかもしれません

そうなんですか 削除/引用 No.251-4 - 2007/09/29 (土) 10:44:27 - たいそん B-ラクタマーゼ分泌のことは知りませんでした。私の場合は、Largeだけでなく、Miniprep (2 ml)でも他のコンストラクトに比べてプラスミドの収量がかなり悪いので、そのせいかどうかわかりませんが、とにかくトライしてみます。

(無題) 削除/引用 No.251-3 - 2007/09/27 (木) 15:21:42 - 中年 大腸菌の増殖に悪さをするプラスミドの場合、アンピシリンが分解されて選択が外れた後にプラスミドを脱落させた菌が増えて、見かけ上は菌が増えているのにプラスミドが取れないことがあります。 ミニプレップでは取れていたプラスミドが培養スケールを上げると取れなくなる場合には、まずこれを疑うべきだと思います。 これを避けるためには、前培養のover night cultrueを本培養に植え継ぐ場合に、一度遠心して上清を除き菌体のみを植え継ぐことで改善されるかもしれません。菌体を新しい培地で一度洗うのも有効だと思います。 関連したトピックが以前にもありました。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=3256

(無題) 削除/引用 No.251-2 - 2007/09/27 (木) 15:09:26 - ~ あまり似ていませんが、BACで１Lあたり1ugしか取れなかったときは、 10L以上培養していました。 ベクターや大腸菌株を代えるのもひとつの対応策ですが、 50mLあたり1ug取れて、必要量が50~100ugであれば、 何も考えずに2.5~5L培養した方が早いと思います。

大腸菌は増えているのにプラスミドが採れない 削除/引用 No.251-1 - 2007/09/27 (木) 14:41:24 - たいそん pBluescriptとDH5aコンピテントセルを使って、マウスの全長cDNAをクローニングしていますが、時折、インサートによっては、LB/Amp中で充分に育って遠心後に大腸菌ペレットが得られるにもかかわらず、プラスミドがほとんど抽出できない（50 ml LB/Amp O/N => 1 ug)ことがあります。同時に処理した他のインサートについては100 ug位のプラスミドが採れています。プラスミド調整にはキアゲンのキットを使っています。この問題のプラスミドについては、何度少量のプラスミドから形質転換をやり直しても十分量（50-100 ug)が採れません。このような経験をされて克服された方、その対処方法を教えていただけるとありがたいです。

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