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酵母のエレクトロポレーション 削除/引用 No.2501-7 - 2008/12/19 (金) 01:01:17 - pai >弘法さん 弘法さんの説明を読んで、LiAc法でやっていくことにしました。 貴重なライブラリーなので、ムラのある操作はやりたくありません。 弘法さんの教えてくださったサイトを参考にして、形質転換効率が最も高くなるヒートショック時間を探していこうと思います。 ご親切に教えていただき、本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2501-6 - 2008/12/18 (木) 10:47:02 - 弘法 エレクトロポレーションは効率が高いように宣伝されていますが、酵母の場合は結果がブレがちだと思います（私の実験が下手なのかも知れませんが）。また、micro gあたりの形質転換効率は良くとも、DNAの量を増やすと急速に効率が低下するため、大規模なスクリーニングの場合にはスケールを上げ辛いのではないかと思います。 どの位の効率を求めていらっしゃるかに依りけりですが、LiOAc/PEG法だと安定して10^5/micro g強程度は出ますし、性格の良い株で注意して実験すればさらに一桁上がります。以下のサイトの方法が広く使われています。 http://www.umanitoba.ca/faculties/medicine/biochem/gietz/Trafo.html

酵母のエレクトロポレーション 削除/引用 No.2501-5 - 2008/12/18 (木) 02:24:11 - pai >弘法さん 酵母による遺伝子実験法 (バイオマニュアルシリーズ)を見たところ、LiAc法に比べて、エレクトロポレーション法は形質転換効率が一桁以上高いという記述がありました。このため、エレクトロポレーション法を試みています。 しかし、弘法さんの実体験もありますし、どうしようかと悩んできました。 それから、パルスの形ですが、今回使用した機器はBioradのMicroPulserであり、調べたところ、これはエクスポネンシャル減衰パルスでした。特許文献の中ではBioradのGene Pulserが用いられています。Gene Pulserのパルスの形が分からないのですが、同じ機器を用いた方が無難ですかね。

(無題) 削除/引用 No.2501-4 - 2008/12/17 (水) 18:18:00 - 弘法 私自身は酵母のエレクトロポレーションは、効率が大きくブレたりあまり良い経験がないので、形質転換は専らLiOAc/PEG法でやっています。その方が多くの場合は効率も良いと思います。特にエレクトロポレーションを選ぶ理由がおありでしょうか。 エレクトロポレーションに関しては、装置によるパルスの形（矩形かdecayか）が効くという話を聞いたことがありますが、聞きかじりなのでさだかではありません。特許で使われている装置と同じものをお使いですか。

酵母のエレクトロポレーション 削除/引用 No.2501-3 - 2008/12/17 (水) 18:06:12 - pai >ソルビトールさん 書き込みありがとうございます。返事が遅くなり申し訳ありません。 ソルビトールさんの書き込みを見て、特に自分の操作に問題がないことを確認できました。ただ、そうなると、なぜ自分の操作で生えてこないのか疑問が残ります。慣れの問題なのでしょうか。 また、書き忘れていたのですが、今回ライブラリーのDNAを用いてエレクトロポレーションしようとしているので、できるだけ効率を上げたいと考えています。

(無題) 削除/引用 No.2501-2 - 2008/12/15 (月) 18:02:01 - ソルビトール 私はエレクトロポレーション後、氷冷した1Mソルビトールを入れたサンプルをすぐに１Mソルビトール入りの選択培地（SD-Ura培地）にまいていますが、問題なく生育してきています。 効率を気にしなくてもよいのであれば、 �@OD600が1.3から1.5になった100ml程度の培養液を集菌（5000g、５分） �A氷冷した滅菌水に懸濁し、5000g、５分で遠心（２回繰り返す） �B最後に氷冷した１Mソルビトール溶液に懸濁し、5000g、5分遠心（ソルビトールでのwashに使用する溶液量は10ml程度でも懸濁できれば大丈夫だと思います。） �C１ml程度の氷冷した１Mソルビトールに懸濁し、1回のエレクトロポレーションに100μL分使用しています。 �Dエレクトロポレーションの条件はpaiさんの条件で行い、（DNAはもっと少ないですが・・・）その後500μLの氷冷した1Mソルビトールを加え、サンプルをすぐに１Mソルビトール入りの選択培地（SD-Ura培地）にまいて、30度で培養しています。

酵母のエレクトロポレーション 削除/引用 No.2501-1 - 2008/12/14 (日) 16:01:26 - pai 酵母のエレクトロポレーションを行っているのですが、うまくいかず、周りに酵母のエレクトロポレーション経験者もいないため、困っています。 基本的に、以下の特許文献の『EXAMPLE 1』の操作に従いました。 http://www.google.com/patents?id=B2QWAAAAEBAJ&dq=5879891 親株はS. cerevisiaeです。 プラスミドは制限酵素で切断せずそのまま使用、 プラスミド量は光度計で測定して約90ngを供試しました。 エレクトロポレーションは、BIO-RADのMicroPulserを用いて、2mmキュベットを使用し、1.5kV、5mSで行いました。 過去の書き込みを見ますと、電流を流して1Mソルビトール液を添加した後１時間静置→1mlのYPDを添加で３０℃震盪培養するといいようですね。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;start=1;Code=1004 今まではソルビトールを加えた後すぐにプレートに播いていたので、ここを修正しようと思います。ただ、1Mソルビトール液を添加した後の１時間静置の温度が分からないのですが、室温でいいのでしょうか、氷上がいいのでしょうか。 この他にも何か改善すべき点があるでしょうか。何でもかまいませんのでアドバイスをお願いします。

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