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(無題) 削除/引用 No.2499-6 - 2008/12/20 (土) 14:45:32 - おお > > ＞おおさん > dNTPを過剰に加えれば3'exo活性は抑えられるということですかね…？？ 理論的にはそうだと思います。実際ブラントの処理の時には 過剰にdNTPが入っているのでDNAの消化は起こりません。 ただ次のステップに入る時そのステップの酵素をなるべく除く のが基本です。dNTPを過剰に入れ続けながら、次のステップ をする人はあまりいないと思います。考えないといけない ファクターが増えますから、バッファーのちがいとか、 dNTPの次のステップえの影響、遊離した燐酸の影響、 消化物の影響、、、、次のステップが理想の反応条件から 離れていっていることがなんとなく想像できますよね。 > > ベクターもインサートもbluntingでやろうとしてましたが、 > ちょっと無謀かもと思いサイトをもう1回探してみたら、 > 片方は突出で手がつなげそうです。 サイト見つかって良かったですね。ブラントよりは楽になるかと思います。 ブラントでもしっかりコントロールされた条件でやればそんなに難しい ことではないので、無謀とはいいませんが、粘着末端を利用した方が いいのは確かです。

コメントありがとうございます！！ 削除/引用 No.2499-5 - 2008/12/19 (金) 19:37:18 - ルル お返事遅くなってしまいましたが、早々に拝見しました！ ＞APさん うちにはT4 DNAしかないみたいなので、フェノール抽出、エタ沈してからLigationすることにしました。 熱処理or vortexで失活してそのままLigationできたらラクだったのですが、 怖いのでやめときます！ 今まで３７℃で反応させてbluntingしてましたが、 それだと3'exo活性が強くなってしまうのですね！あわわ… 今度から１２℃でやってみます。 ＞おおさん dNTPを過剰に加えれば3'exo活性は抑えられるということですかね…？？ ベクターもインサートもbluntingでやろうとしてましたが、 ちょっと無謀かもと思いサイトをもう1回探してみたら、 片方は突出で手がつなげそうです。 頑張ってとります！！

(無題) 削除/引用 No.2499-4 - 2008/12/14 (日) 01:06:04 - おお 重複してますが、T4DNApolはDNAの3'側から 消化するヌクレアーゼ活性があります。dNTP存在か ではこの活性と、ポリメラーぜ活性が平衡状態に あり、ブラントの状態が維持されるのですが、 時間とともにdNTPは消費されますから、消費 されたあとは、ヌクレアーゼ活性が優位になり、 DNAは削れて、消化されてしまいます。 APサンの指摘のように、T4DNApol処理後は 上記の理由によりT4DNApolの失活の処理は必須です。 ベクター側の場合はライゲーションの前に フォスファターぜ処理をしとかないと セルフライゲーションの頻度が上がり 目的の物を探すのに大変効率が悪くなります、 というか不可能に近くなるとおもいます。 ライゲーションの効率はPEGなどの添加で かなりあがるようです。添加量などは 今覚えていませんが、GIBCO(インビトロジェン) のライゲーションバッファーには含まれています。 うまくクローンが拾えると良いですね。

(無題) 削除/引用 No.2499-3 - 2008/12/13 (土) 23:52:06 - AP T4 DNA polもKlenowも、最近では専用バッファーを添付して販売されていることが多いですが、もともと制限酵素バッファーなどにdNTPを加えただけでも、十分な活性を示します。ですから、制限酵素消化後、（可能なら熱失活して）0.1 mM each程度のdNTPを加えて酵素を加えるのが簡単です。 制限酵素消化したDNA断片などは、熱失活してそのままligationに持っていくこともありますから、bluntingしたものをそのままligationに持っていくのだってOKでしょう。 ただし、T4 polの場合はフェノール抽出した方がいいでしょう。 T4 polは伸長活性の他に、強い3' exonuclease活性があります。5' 突出端をfill-inしてbluntingすることも3'突出端をpolish-upしてbluntingすることもできますが、反応条件によって容易に3'exo活性が優位になって削りこみが起こってbluntingに失敗します。熱失活もしにくく、温度が高いと削り込みが起きやすいので、フェノール抽出で止めるのが安全です。 もし、fill-upだけが目的ならKlenowのほうが安全です。Klenowの3' exonuclease活性は伸長活性に比べるとはるかに低いからです。Klenowなら熱失活だけで次のステップにいって大丈夫です。 なお、bluntingのこつはexo活性が過剰に働かないようにすることで、温度低くする（T4なら12℃、Klenowならr.t）、酵素を入れすぎない、反応時間を長くしすぎない(15-30 min程度、長すぎるとdNTPが枯渇してexo活性に転じる）などです。 >そのままLigationに持っていくことはできるのでしょうか？ 失活させる操作は必要と思います。そうでないと、dNTPが枯渇、あるいは濃度低下によって削れこみが誘発される危険があります。

blunting→Ligation 削除/引用 No.2499-1 - 2008/12/13 (土) 22:39:08 - ルル 今、平滑末端同士でのLigationを行おうとしています。 そこで、bluntingからそのままLigationに進むことはできるのでしょうか？？ 具体的には、 reaction mixtureにT4 DNA polymeraseを加え37℃10min反応したあとに、 そのままLigationに持っていくことはできるのでしょうか？ 2×Ligation Mix ( Ligation-Convenience Kit )を用いれば 反応溶液に2×Ligation Mix を加えて16℃5〜30min反応させるだけでLigationできる、と見たことがあるのですが、 うちの研究室では、 　・T4 DNA Ligase 　・10×Ligation buffer 　・vectorDNA 　・insertDNA を自分で混合してLigationを行っています。 この場合でもそのままvectorDNAやinsertDNAの代わりにbluntingの反応溶液を使ってできるのでしょうか？ また、blunt end同士のLigation効率を良くする方法などありましたら教えてください！ よろしくお願いします。

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