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(無題) 削除/引用 No.2495-13 - 2008/12/19 (金) 10:17:08 - おお >[Re:12] Aさんは書きました : 、 > > > ぼすは、均一ゲルでBPBを流し切ってさらにえいどうしろと > > の様な方法を使っています。比べたいサンプルを隣同士にして10%ゲルに流しBPBを流しきってから30分流すと微妙な違いがわかります。一度試しに45分流したことがあるのですがここまで流すとバンドが広がってしまいその違いがわからなくなりました。 BPBを流し切ってそんなにまがない状態だと確かに バンドはそんなに悪くはならないでしょうね。 それでじゅうぶん分かれればいいのですが、 もともとほぼダブっているバンドを分けるには ちょっと十分ではないかなという気がします。 若干長めに流すのは必要におおじて、やってみる ことにします。 それにしても小さいげるでえいどう距離をかせぐより、 大きいゲルにして普通に(BPBがボトムに来るていど) 流した方がきれいになると思えるのですが、 これは何ででしょうね、同じようにえいどう距離 を長く取っているわけですが、、、ランニングバッファー からくるバッファーの持ち込みが原因なのかな、、、

(無題) 削除/引用 No.2495-12 - 2008/12/18 (木) 23:25:21 - A 直接役に立たないかもしれませんが参考までに。 私の扱っているタンパク質は約47Dkaで部分的分解が起こると活性を失います。この不活性なサンプルと活性を持つサンプルの違いをWBで確認する際におおさんのボスが言っている、 > ぼすは、均一ゲルでBPBを流し切ってさらにえいどうしろと の様な方法を使っています。比べたいサンプルを隣同士にして10%ゲルに流しBPBを流しきってから30分流すと微妙な違いがわかります。一度試しに45分流したことがあるのですがここまで流すとバンドが広がってしまいその違いがわからなくなりました。この辺りの時間が肝の様です。うちの研究室の予算の関係でそうそうマススペクトルなどを計れないのでその分子量の違いがどれぐらいなのかは残念ながら不明です。

(無題) 削除/引用 No.2495-11 - 2008/12/16 (火) 08:04:03 - おお >[Re:10] あべちゃんさんは書きました : ｷﾀｷﾀ━━━━(ﾟ∀ﾟ)━━━━ｯ!! > もしも目的蛋白質が小さいなら、 > Tricine-SDS-PAGEなるものがあります。 > Nature Protocol, 2006 vol. 1 (1) pp. 16-22 TRICENEのやつは低分子もきれいに分かれますようね。 グラジエントゲルのような幅広いサイズで分解能が ありますし。 もしかしたら、このシステムで6%ぐらいのゲルをつかうと、 高分子の分解能の高いえいどうが、、、できたりしないか。 オリジナルはAnalBiochemでメソッドインエンザイモロジーにも でていたと思います。コピー持っているはずなんだけどなぁ > Rさんのコメントにもありますが、このTricine-SDS-PAGEでも、Ureaを加えることでよりいっそう低分子蛋白質の分離能が改善しているように見えます。 ウレアですか。いろいろな人がそういう言うということは 確実に改善されるんでしょうね。 BisTrisでえいどうバッファーでえいどうパターンが 変わるって仰ってましたね、、、どこのとピだったかな、、 さがしてみよっと。

(無題) 削除/引用 No.2495-10 - 2008/12/15 (月) 20:44:04 - あべちゃん もしも目的蛋白質が小さいなら、 Tricine-SDS-PAGEなるものがあります。 Nature Protocol, 2006 vol. 1 (1) pp. 16-22 ハーマンシェーカー先生のところで開発されたSDS-PAGEで３０ｋDa 以下の蛋白質で威力を発揮します。 この論文はフリーアクセスなので、一度ごらんになればわかりますが、低分子蛋白質が見事に分離されています。 個人的にこのメソッドの欠点と思われるのは、泳動時間がかなりかかる点です。 速くしようと電圧をかけすぎると、バンドが笑ってしまいます。 Rさんのコメントにもありますが、このTricine-SDS-PAGEでも、Ureaを加えることでよりいっそう低分子蛋白質の分離能が改善しているように見えます。

(無題) 削除/引用 No.2495-9 - 2008/12/14 (日) 05:53:07 - おお >[Re:8] （＋）（−）さんは書きました : > 途中で一時的に電荷（プラスマイナス）を逆にする。これを何回か繰り返すと分離（解像度）がよくなるときがある（らしい）。試したら教えてください。 すげーだんだん裏技チックになってきました。 そういえばアポトーシスで、ラダーをシャープに 見せるために、最後に一瞬逆に流したらいいと いううわさを聞いたことがあります。 １度バンドの形が上下逆様じゃないかとおもう ようなイメージがパブリッシュされているのを 見たことがあるので、ほんとかもなんて思って たのですが。 SDSPAGEで逆は勇気がなかったですね、、、 再現性を考えるとなんだかパルスフィールド を使って流したくなってきました。 じつはあまり試すほどよゆうがないというか、 ほかの人がほかのプロジェクトで、関係ない バンドとほとんどだぶってて、目で見れは コントロールとの比較で分かるのですが、、 パブリッシュするには、何とか分けたい と考えているみたいで、我が身にそういうのが 降りかかってきたらさてどうするだろう とか思っていたわけです。 >[Re:7] 通りすがりさんは書きました : > 細胞周期関連のタンパクとかでリン酸化バンドと..... > Bisとアクリルアミドを別々に購入してて自分のとこでmixしてやってるタイプのラボなら特に何も買わずにすぐにでも試せるのでおススメです。 > >あとは、ビスとアクリルアミドの比率を変える。ただし、目的の条件見つけるまで試行錯誤必要。これは実際やって効果ありました。 なるほど、燐酸かに関してはたしかにこれは 効果がありありそうです、燐酸がつくことによって SDSのネガティブチャージとのリパルジョンがおこり、 構造に変化がありそうです。燐酸か部位がN末とか C末近傍だとどの程度効果があるんだとうとか 思ったりもしますが、、、、

(無題) 削除/引用 No.2495-8 - 2008/12/14 (日) 04:20:43 - （＋）（−） 途中で一時的に電荷（プラスマイナス）を逆にする。これを何回か繰り返すと分離（解像度）がよくなるときがある（らしい）。試したら教えてください。あとは、ビスとアクリルアミドの比率を変える。ただし、目的の条件見つけるまで試行錯誤必要。これは実際やって効果ありました。

(無題) 削除/引用 No.2495-7 - 2008/12/13 (土) 12:56:20 - 通りすがり 細胞周期関連のタンパクとかでリン酸化バンドと 非リン酸化バンドの分離をよくしたいときやる方法ですが Anderson Gelという 一般に使われるLaemmli gelとはBis/AAの比率が違うゲルを使うと かなり分離がよくなり改善されることが多いです。 多いというか100kDa以下のたいていのタンパクなら 間違いなく分離はよくなります。 別に細胞周期とかに限らずリン酸化関係なら知ってて損しない方法です。 Bisとアクリルアミドを別々に購入してて自分のとこでmixしてやってるタイプのラボなら特に何も買わずにすぐにでも試せるのでおススメです。 組成は http://www.pangloss.com/seidel/Protocols/proteingel.html referencesは Anderson, C.W., Baum, P.R., and Gesteland, R.F. (1973). Processing of adenovirus 2-induced proteins. J. Virol. 12, 241-252 使用して効果をあげてる論文の例としては Marumoto T, Hirota T, Morisaki T, Kunitoku N, Zhang D, Ichikawa Y, Sasayama T, Kuninaka S, Mimori T, Tamaki N, Kimura M, Okano Y, Saya H. Roles of aurora-A kinase in mitotic entry and G2 checkpoint in mammalian cells. Genes Cells. 2002 Nov;7(11):1173-82. ちなみに尿素もある程度効果がありますが、ゲルを 作るときに暖めたりしないとうまく均等に固まりにくくて ちょっと面倒くさいのです。

(無題) 削除/引用 No.2495-6 - 2008/12/13 (土) 11:43:09 - おお >[Re:5] Rさんは書きました : > ゲルに6Mの尿素を添加すると分離が改善する場合があります。 尿素ですか。たしかにためしてみる価値はありそうです。 そのほかたまに使われる添加物は、 グリセロールはシュークロースでしょうか、、 尿素ほど期待できないかもしれませんね、、 思い切っていろいろなものを混ぜてみるかっていう発想に発展しそうです、、、、

(無題) 削除/引用 No.2495-5 - 2008/12/13 (土) 11:30:07 - R ゲルに6Mの尿素を添加すると分離が改善する場合があります。

(無題) 削除/引用 No.2495-4 - 2008/12/13 (土) 11:15:27 - おお グラディエントゲルで十分なえいどう距離がかせげるまで流す というのは、確かにいいかもしれません。 ぼすは、均一ゲルでBPBを流し切ってさらにえいどうしろと よくいうのですが、きれいにいった試しがありません。 そういえばほかのとぴで、大きいゲルを使っている方が いましたね。

(無題) 削除/引用 No.2495-3 - 2008/12/13 (土) 10:23:31 - ~ スマートなやり方ではありませんが。 グラディエントゲルで、ゲルの下の方まで流して何とかしていました。 ゲルのサイズを長くしたこともあります。

(無題) 削除/引用 No.2495-2 - 2008/12/13 (土) 10:00:25 - おお ちょっと分かりにくい質問になってますね。 二つのバンドというのはほとんど移動度が 変わらず分離しにくいという意味です。

SDSPAGEで2つのバンドの分離を上げたい時 削除/引用 No.2495-1 - 2008/12/13 (土) 08:59:17 - おお SDSPAGEで2つのバンドの分離を上げたい時で2つのバンドの分離 を上げたい時どのような工夫が考えられますか。 燐酸かであれば燐酸かタンパクの移動度をおくらす添加物が 考えられます。 そのほか何か試してよかった(燐酸かに限らない)方法が あればおききしたいと思います。 例えばゲルのSDSを抜くと、解像度という意味ではなく、 非常に近い2つのバンドの移動度に違った影響がでて、 うまく分かれたとか、 TRIS-HCl(pH8。8)でなくBisTRISにしたらえいどう パターンが若干変わって、目的の2つバンドを うまく分けれたとか、、、 いろいろご意見いただけたらとおもいます。

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