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(無題) 削除/引用 No.2492-11 - 2008/12/16 (火) 19:12:09 - MO 中年様 　ご指摘ありがとうございます。本当ですね、見落としていました。 これらのベクターの使用も視野にいれたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2492-10 - 2008/12/15 (月) 11:07:40 - 中年 Novagen（今はTaKaRa？）のpETベクターのシリーズに10xHisのものがいくつもありますよ。

(無題) 削除/引用 No.2492-9 - 2008/12/15 (月) 06:52:28 - MO 皆様、たくさんのご意見、アドバイスをありがとうございます。 　弱いなりに吸着しているため、現在のところNi-NTAカラムと他のカラムとの組み合わせである程度精製はできています。 　ただ「Hisタグを長くしたら？」というアドバイスに対してそうゆう手法が一般的に有効なのか疑問を持ったためトピックをたてさせていただきました。アドバイスに中にもありましたが、調べた限りでは市販されているベクターのHisタグは6個が一般的でしたので。 　でもやはりHisタグを長くして有効だったという具体例もあるのですね。貴重な情報ありがとうございました。もし可能でしたら具体的な文献情報をいただけると助かります。 　その他、バッファー条件やレジンに関するアドバイスもありがとうございました。検討させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.2492-8 - 2008/12/14 (日) 21:30:57 - ぶりぶり 　バッファー変えたり、コンストラクト変えたりという意見が多いので、一つ追記を。 　レジンのメーカーを変えるのも一つの方法だと思いますよ。 　先に書かれていたCoレジンは、Niよりも結合力が弱いから非特異が減って純度が高くなる傾向にあるけど、Niで20mMでも溶出してしまうので、Coならもっと結合できない可能性はあります。 　お使いのNiレジンがNi-NTAなのかNi-IDAなのかは不明ですが、もしNi−NTAならNi-IDAに変えるだけでもHis-tagとレジンとの結合力は上がりますよ。純度は下がるかもしれないがNiからCuに変えるのも結合力は上がります。 　またメーカーによって還元剤やキレート剤にたいする許容濃度が異なるので、レジンのメーカーを変えるだけでも結果は変わってきます。 　昔のレジンはbeta-mercaptしかダメでしたが、最近のレジンはDTTでもOKだし５mM DTTとか10mM DTTとかでも使えるようになってきたので、いろいろなメーカーのレジンを使い分けるのも精製の幅が広がります。

(無題) 削除/引用 No.2492-7 - 2008/12/13 (土) 08:24:38 - 名無し 論文か、Niレジンの説明書か何かで9xHisというのを見たことある。6xHisでやってコンタミが多く純度があがらないときそうするといいと書いてあったように記憶している。（実際培養細胞とかだとNiカラムに親和性のある蛋白質が非常に多いので６Hisタグだけで高純度の蛋白質を得るのは困難。）つまり６Hisだと溶出されてしまうくらいの高濃度のイミダゾルで洗い、そのあとでさらに濃度をあげて９XHis蛋白質を溶出するということだったとおもう。 6Hisでつきが弱いという経験はないので原因はわからないけど、吸着を妨害する恐れのあるものもの（キレート剤、還元剤、SDSのようなイオン性界面活性剤、培地成分など）の有無は確認した方がいいとおもう。また蛋白質の高次構造上の問題が考えられそうなら６M　GdnHClまたは８M 尿素存在下の変性条件で行えば解決するとおもう。

(無題) 削除/引用 No.2492-6 - 2008/12/13 (土) 01:26:18 - tx Hisは長くすると吸着が良くなると思いますよ。弱くても今のコンストラクトで吸着してるんだったら、長くすると今よりは精製度はあがるでしょう。あるいは長くしないで、NとCの両方に6xHisを持たしても吸着度はあがる可能性大だと思います。ちょっと不細工だけど背に腹はかえられない時に。。。 あ、Ni-NTAは還元剤は良くないです。beta-MEで1mM以下でしか使用不可だと思います。念のため。あとご存じかと思いますが、pHは高めに。

(無題) 削除/引用 No.2492-5 - 2008/12/13 (土) 01:14:36 - りょう 他の方の意見同様、僕も20mMで溶出されてしまうなら洗浄時のイミダゾール濃度を0, 5, 10くらいで検討しますね。 他の改善点：Ni-resinよりCo-resin（クロンテックのTALON)の方が好きです。こちらの方が精度は良い気がします。結合力の違いは不明。

(無題) 削除/引用 No.2492-4 - 2008/12/13 (土) 00:57:54 - おお 20mMのイミダゾールの入ったバッファーでカラムに ロードしているのでしょうか。 そうであればもっと低い(極端にイミダゾール0mM) イミダゾール濃度でカラムにのっけてみてはどうで しょうか。 あとはバッファーのpHを高めにするとか、バッファー にトリスを使っているなら燐酸バッファーにかえるとか、、 ま同時にあたらなコンストラクトを考えてもいいかと思いますが、 N末につけてるならC末にかえるとか、、、 HISはたしかに長い方が有利だと思います(いろいろな意味で) が、どうしても数だけを 増やしてアフィニティーをあげたいなら、いまの6xHISとタンパクの あいだにHHHHHH...PPPP(N末のれい)てな感じでタンパクとの間にスペーサーを かまして増やしますね。 pETのシリーズであればフレームを気をつければN末、C末ともHISがつけれるよう になったものもあったと思いますし、キアージェンはHISが連続していない 配列でNiカラムに吸着できるシーケンスを使ったプラスミドを売っていた と思います。 いずれにしろ、よく考えてからてをつける方が いいかなと思います。

(無題) 削除/引用 No.2492-3 - 2008/12/13 (土) 00:22:20 - A His-tagを6残基を超えて使ったという話は聞いたこと無いですね。MOさんにアドバイスした方がHis-tagでのタンパク精製の経験をどれぐらいお持ちなのかわかりませんが新しいコンストラクションを作る前にまずは現在の実験方法について出来る限り詳細にここに投稿されては？たとえば、精製はネイティブなのか変性状態で行われているのか、20mMイミダゾール（洗いだと思われますが）で溶出されてしまうということですがイミダゾールを含まないバッファーでの洗いを行っても取れてしまうのか、His-tagの位置はN末ですかC末ですか、それは予想される3次元構造からして外部に出ていると考えられますか、などです。それでもなお問題が解決できないのであればHis-tagを伸ばし、出来ることならその結果どうなったかもここに書き込んでもらえると助かります。

(無題) 削除/引用 No.2492-2 - 2008/12/13 (土) 00:16:25 - ぶりぶり >[Re:1] MOさんは書きました : > 　現在His-Tag融合タンパクの精製を行っていますが、20mMイミダゾールで溶出されてしまいます。それでHis−Tagを長くしてはどうか、というアドバイスをいただきました。 　まずはアドバイスを頂ける環境にあるようですので、アドバイザーにHis８とかHis１０で本当に吸着が良くなるのかどうか尋ねてみるのはいかがですか？（私は良くなる時もあるという認識を持っています。） 　His8とかHis10とかのベクターが実際に販売されているのか？また販売されているようなら、その添付文書とか広報物とかに書かれているアピールポイントを読んでみる。という流れで調べてみるのはどうでしょうか？ 　20mMで溶出されて困る理由はなんでしょうか？別に20mMで溶出しても、精製純度が高ければそれで目的は達成されていることになりますよ。溶出された蛋白を電気泳動したら純度が悪かったという意味ですか？ 　His-tagは構造的に表面に出ていますか？His6の吸着が弱い＝His-tagがNiと十分に相互作用できる環境にいない＝蛋白に埋もれているのでは？という予想から、Hisを伸ばすついでに、C末⇔N末でtagの位置を変えたプラスミド を同時に準備したほうが良いかもしれませんね。だってHisを伸ばして疎水性も上がるからますますtagが埋もれてしまう事だって起こりそうだし。 　還元剤を入れたり、グアニジンか尿素を入れて蛋白の構造を変えてみるのも一つのアプローチとして考えてみるのはいかがですか。

His Tag の長さについて 削除/引用 No.2492-1 - 2008/12/12 (金) 20:34:24 - MO 　現在His-Tag融合タンパクの精製を行っていますが、Ni-resinへの吸着が弱く、20mMイミダゾールで溶出されてしまいます。それでHis−Tagを長くしてはどうか、というアドバイスをいただきました。 　His-Tag はHis6個のヘキサヒスチジンタグです。これを8個、10個と長くすると吸着がよくなるものでしょうか。あまり変わらないのでしょうか。一般的に使用されているヒスチジンタグの長さは6個ですが、それより長いヒスチジンタグについて使用例をあまり聞きません。どなたか経験がある方がおられましたら情報をお願いいたします。

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