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(無題) 削除/引用 No.2489-10 - 2008/12/16 (火) 04:11:05 - 免疫屋 とっさに論文が出てきませんが，K48やK63のみを残して残りのKを変えることは常法としてよく行われていますので，そういうプラスミドを持っている研究室に当たってみても良いかもしれません． 仮にK63のみ残存およびK48のみ残存のユビキチンしか入手できなくとも，ユビキチン鎖の特徴（K63かK48か）がわかりますし，この二つだけで多くの場合ユビキチンの鎖状化を抑制できますのである程度目的の実験を遂行することが可能と思います． 例えば 「K48（のみ残存）ユビキチンを使った場合タンパクBはポリユビキチン化（鎖状化）されるが，K63（のみ残存）ユビキチン使用の場合はポリユビキチン化されない．タンパクAとの結合はK48ポリユビキチン鎖の場合にのみ生じる」といった感じでしょうか． もちろん，これらのK48あるいはK63にmutationを入れれば完全に鎖状形成しないユビキチンとなりますので，そういう形も可能と思います． 不十分な情報で恐縮ですが． > ＞免疫屋さん > > 『鎖状形成を抑制するmutationを入れたユビキチンを利用し』 > これを使用している論文をご存知でしたら教えていただけませんでしょうか。 > > 宜しくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2489-8 - 2008/12/15 (月) 12:45:22 - ユビキチン素人 免疫屋さん、txさん、コメントありがとうございます。 ＞免疫屋さん 『鎖状形成を抑制するmutationを入れたユビキチンを利用し』 これを使用している論文をご存知でしたら教えていただけませんでしょうか。 宜しくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2489-7 - 2008/12/13 (土) 07:05:19 - tx 私の扱う分子種はユビキチン化を受けるといった報告はありませんでしたので、アライメント情報より保存されていないKをピックアップし、他分子の結晶情報とてらしあわせて候補を絞りました。おおさんがおっしゃるように、へリックス間のループにある複数のKが候補となりましたので、以下、よくある実験を行い確認しました。参考にならないかもしれませんが一例でした。

(無題) 削除/引用 No.2489-6 - 2008/12/13 (土) 06:59:25 - 免疫屋 「ポリユビキチン化（ユビキチン鎖形成）」が結合を仲介するか否かという部分のみに関心があるのであれば，鎖状形成を抑制するmutationを入れたユビキチンを利用し，結合が阻害されるか否かを確認する．．という手もあるかと思います． 複数箇所のユビキチン化は防げませんが，いわゆるポリユビキチン化（直鎖形成）は抑制できますので，モノユビキチン化状態との比較はある程度可能だと思います．ポリユビキチン化が必要か否かという観点についてあたりをつける実験としては手頃で良いのではないでしょうか． （ポリユビキチン化とモノユビキチン化では認識タンパクなども異なってきますので今回の件も結合活性に違いが見えてくるかもしれません） もしユビキチン化と非ユビキチン化状態の比較をなさりたいのであれば，皆さんおっしゃるように一つ一つユビキチン化サイトを決めていくしか方法はないかと思います．

(無題) 削除/引用 No.2489-4 - 2008/12/13 (土) 05:48:10 - ユビキチン素人 コメント有難うございます。 なかなか当たりをつけるというわけにもいかなそうですね。。。 うーん。時間がかかりそうだ。

(無題) 削除/引用 No.2489-3 - 2008/12/12 (金) 14:53:58 - おお ユビキチン化はかなか手強いという印象があります。 実際ユビキチン化したところを同定して、つぶしても 近くのリジンがユビキチン化されたりでいたちごっこに なることもうわさであると聞きました。 でどうしてもユビキチン化されないようにするために その辺のリジンをしがみつぶしに変異を導入した という話も聞きます。そんなことしたらタンパク 自体違うものになってしまうのではなんて思ったりも します。 ヒントとなることとしては特定の構造をとらない ヘリックすとかベーターシートのあいだにある ループのあたりがよくターゲットになると聞いたこと があります。 この辺はたしか同僚がレビューとか見てたと思います ので、PUBMEDなどで検索すると出てくるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2489-2 - 2008/12/12 (金) 14:33:36 - 名無し ユビキチン化された蛋白質Bをある程度部分精製してからトリプシンで分解して、得られたペプチド群をLC/MS/MSで分析すると分かるとおもいます。ユビキチンプロテオミクスの論文みれば出ているとおもいます。ユビキチンのC末端数残基が蛋白質B由来のペプチドのりジン残基に結合したT字状の特異なペプチドを見つければよいのです。

ユビキチン化の位置を知りたい 削除/引用 No.2489-1 - 2008/12/12 (金) 13:00:43 - ユビキチン素人 こんにちは。 詳しい方に教えて頂きたくトピックを作らせて頂きました。 今ターゲットにしている因子（仮にAとします）が、あるポリユビキチン化したタンパク質（B)と結合するとポリユビキチン化を解除して安定化させているようだ、という結果を得ました。 AとBの結合がBのポリユビキチン化に依存していることを証明したいと考え、このBのリジン残基を変異させたいのですが、Bのどのリジン残基がユビキチン化されるのかという報告は今の所ありません。 ユビキチン化されるリジンの当たりをつけたいのですが、モチーフなどは存在するのでしょうか？ ユビキチン化に関しては全くの素人なので、サイトや論文などなんでも結構ですので教えて頂けないでしょうか？ 宜しくお願いします。

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