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(無題) 削除/引用 No.2484-11 - 2008/12/12 (金) 11:21:13 - おお >[Re:10] EcoRIさんは書きました : > 例えば、K株のDH5aは、外来遺伝子の分解や組換えに関わる遺伝子recAやendA...... > 一方で、BL21にはそのような変異は無いので、タンパク質発現に用途を限った方が安心できます。 全くその通りだと思います。

(無題) 削除/引用 No.2484-10 - 2008/12/12 (金) 11:18:30 - EcoRI 私もコンストラクトの構築・維持はK株でなされるべきだと思っております。 研究を始めるにあたって、そう習いました。 おおさんの仰るように、形質転換効率もありますが、遺伝子型も気になるところです。 例えば、K株のDH5aは、外来遺伝子の分解や組換えに関わる遺伝子recAやendAに変異が入っており、 プラスミドが(理論上は)安定に維持されます。 一方で、BL21にはそのような変異は無いので、タンパク質発現に用途を限った方が安心できます。

(無題) 削除/引用 No.2484-9 - 2008/12/12 (金) 11:04:16 - おお >[Re:8] 千夏さんは書きました : > >しかし、ベクターとインサートに分けてゲル電した場合にベクターが1kbくらい下に見えるのが自分の中で問題となってます…。 > > 流すDNA量を検討してみてください。ligationに用いたinsertの量と制限酵素処理をしたときにできるinsertの量（plasmid 3kbでvector 2kb, insert 1kbならば3 ng流した時のinsertの量は1 ng)。　流しているDNA量が多いとbandが目的よりも下のサイズにでます。50~200 ng/laneで検討してみてくださいｖ バンドに厚みがある時(上から見て)バンドの中心でなくて、上(ウェル) からスキャンして、バンドのシグナルが立ち上がるところでサイズを 見積もりますね。ただ多すぎるとその判断も難しくなってきます。

(無題) 削除/引用 No.2484-8 - 2008/12/12 (金) 10:55:16 - 千夏 >しかし、ベクターとインサートに分けてゲル電した場合にベクターが1kbくらい下に見えるのが自分の中で問題となってます…。 流すDNA量を検討してみてください。ligationに用いたinsertの量と制限酵素処理をしたときにできるinsertの量（plasmid 3kbでvector 2kb, insert 1kbならば3 ng流した時のinsertの量は1 ng)。　流しているDNA量が多いとbandが目的よりも下のサイズにでます。50~200 ng/laneで検討してみてくださいｖ

(無題) 削除/引用 No.2484-7 - 2008/12/12 (金) 10:45:00 - おお 最近このてのとピが増えているのですが、いまはBL21でコンストラクト を作るのが一般的なのでしょうか、、、、、 どこかのマニュアルに書いてあるのかなぁ プラスミドの由来にもよりますけど、BL21とかだと、K株より2オーダーとか トランスフォーメーションの効率がわるく、ライゲーションなので コンストラクト作るには高いトランスフォーメーション効率が 必要というのが一般論と思ってますのでどうも矛盾があるような きがします。 わたしなら、クローニングやサブクローニングでよく使われるK株で コンストラクトを完成させてから、B株(BL21など)に導入しますが、、 細かいところは置いておいて、JM109にライゲーションプロダクト を形質転換してみてはどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2484-6 - 2008/12/12 (金) 10:14:20 - 園児ニアー >　EcoRIさん > このPCRで、circularな何も処理をしていないpGEXをテンプレートにすると、ちゃんとバンドがでますか？ やったことありませんでした…。基本的な確認を忘れてました…。 > 精製のステップを見直すか、キットを導入してみてはいかがでしょう？ キアゲンのプラスミド精製kitを使用して精製してます。なのでRNAの混入はあまり考えられないと思います。

ありがとうございます 削除/引用 No.2484-4 - 2008/12/12 (金) 10:09:46 - 園児ニアー ＞~さん 他のラボに聞きながらやってはいるのですが、教員を通して情報交換しているのとうちの教員がそのラボにあまり聞いてくれないためにわからないことだらけなのです…。 確かに、インサートは入っているのは間違いないと思います。しかし、ベクターとインサートに分けてゲル電した場合にベクターが1kbくらい下に見えるのが自分の中で問題となってます…。 > 2〜3本の場合が良くありますが、DNAが濃いと、7本以上見えることもあります。 3本くらいならよく見てたので違和感は無かったのですが、それ以上出ることもあるとは初耳でした > PCRがうまく行っているかを調べるためのポジティブコントロールはあったのですか？ ポジコンはありません…。よくみてみると、プライマーダマーみたいなのが出来てました。PCRが失敗しいているかもしれませんね…。 もう一度やってみます

(無題) 削除/引用 No.2484-3 - 2008/12/11 (木) 17:46:48 - EcoRI >MSC確認用プライマーを用いてPCRしたところ目的のbpにバンドを確認することが出来ませんでした。 MSC確認用プライマーというのが、どういうものなのかわかりませんが、 おそらく、インサートの外側でbindingするプライマーでしょう このPCRで、circularな何も処理をしていないpGEXをテンプレートにすると、ちゃんとバンドがでますか？ >しかもBL21から抽出したプラスミドには、シングルコロニーから増やしたにもかかわらず7本くらいのバンドがありました ある程度の裁断化を受けたゲノムかRNAでしょうか… 精製のステップを見直すか、キットを導入してみてはいかがでしょう？ 変異云々はシーケンスをしてみればわかるでしょうが、 全部読むのはなんとなく非生産的かもしれません 購入し直すのがいいのでしょうが、それは最後の最後ですね。

(無題) 削除/引用 No.2484-2 - 2008/12/11 (木) 17:20:02 - ~ ラボで初めて系を立ち上げようとしているのであれば、 一度どこかのラボに教わりに行くことをお勧めします。 おそらく、インサートが入っていて、シークエンシングでの確認にまわせるようなプラスミドは取れている状態で、 チェックの方法が間違っているのだと思います。 >7本くらいのバンド ニックが入る、CC,OCなどで1種類のプラスミドが複数のバンドを示すのは良くあることです。 2〜3本の場合が良くありますが、DNAが濃いと、7本以上見えることもあります。 >2本しかありませんでした 高次構造が変わっていても、プラスミドが切れれば構造は解消されます。 そのため、ベクターとインサートの2本のバンドになってもおかしくありません。 >目的のbpにバンドを確認することが出来ませんでした。 どういう結果だったのですか？ PCRがうまく行っているかを調べるためのポジティブコントロールはあったのですか？ プラスミドの電気泳動、制限酵素処理では目的のインサートが入っているであろう結果が得られていますので、 単にPCRで間違いをおかしているだけだと思います。

pGEXへの遺伝子導入 削除/引用 No.2484-1 - 2008/12/11 (木) 16:02:10 - 園児ニアー 現在pGEX-6P-3に遺伝子導入をして、あるタンパク質の精製を目指して日々黙々と実験を行っています。 制限酵素処理・ライゲーションを行いBL21にライゲーションしたプラスミドをヒートショックで導入してアンピシリン耐性コロニーを増やし、プラスミドを抽出して再度制限酵素処理を行ったところ目的のbpにバンドを確認することができました。しかし、MSC確認用プライマーを用いてPCRしたところ目的のbpにバンドを確認することが出来ませんでした。 しかもBL21から抽出したプラスミドには、シングルコロニーから増やしたにもかかわらず7本くらいのバンドがありました･･･。しかし、BamとEcoでDouble digestionしたところ目的遺伝子とその他の2本しかありませんでした。もうわけがわかりません･･･。 手技的な情報は以下の通りです。 pGEXのクローニングにはJM109を用いて増やしてきています。 制限酵素はBamHIとEcoRIです。約10 bp程度しか離れていません。しかし、1つずつ処理しdouble digestionしていないのであまり関係は無いと思っています。 両方で切断した後にCIAPで脱リン酸化してゲル電のゲルから切り出してきています。 そこで原因として ○pGEXのクローニングの際にJM109のrecA遺伝子で変異が起きた株を増やしてしまった ○制限酵素処理で非特異的な切断が起きてしまっている ○UV照射による損傷 などと考えていますが、知識も浅いために結論に達することが出来ません。 (生物系の工学部ですが、遺伝子をやっている先輩もいないため聞ける人がいません・・・) 皆さんの意見をお聞かせください。。

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