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(無題) 削除/引用 No.2482-6 - 2008/12/11 (木) 17:07:03 - ~ 3種類はあっているでしょう。 ただ、入れ方や細胞によりますが、１の細胞は、10^(4〜7)細胞あたりに1個くらいでしょう。 そのため、だんだん少なくなっているというのは、おかしくない結果です。 pIRES2-GFPにはネオマイシン耐性遺伝子がのっていますので、 G418で選択してはいかがでしょうか。 適切な濃度を決めるために1回予備実験が必要かもしれませんが、 G418で選択している条件で増えてくる細胞は、少なくともネオマイシン耐性遺伝子部分が発現している細胞です。 その中でIRES2-EGFP部分を発現している細胞はそれなりに多いことが期待されます。

ありがとうございます。 削除/引用 No.2482-5 - 2008/12/11 (木) 16:35:53 - むら ありがとうございます。 ということは、私の頭の中では、 １．transfectionしたプラスミドの一部が 　　細胞株に取り込まれ、安定して発現するクローンのものと、 ２．徐々に消失していくクローンのものと、 ３．transfectionされてなかったものと、 ３種類が発生すると考えていたのですが、１つめは出てくるためには 他の手段を講じないとだめだということでしょうか？ 目的はstable constructをソーティングでとってこようと思っているのですが、 別の方法が必要ということしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2482-4 - 2008/12/11 (木) 15:27:19 - おお すでにある回答を言い換えただけにすぎないですが、 トランスフェクションしたプラスミドは増殖と ともに希釈され細胞あたりのプラスミド数は 減っていきます(薬剤で維持したりとか ほかにてを加えてない限り)。 さらにプラスミドは細胞にとって外来のDNAですので、 分解されるものもあるでしょう。 だから、維持するために何ら対策をとってない のであれば発現は、増殖(とけいだい)に伴って どんどん落ちていきます。

(無題) 削除/引用 No.2482-3 - 2008/12/11 (木) 14:59:28 - 1 下の方がおっしゃてるように なんと言うかすごく当たり前の話なんですが。 Iresの前に何も入れてないのとかを controlとして用いて 同時にtrasfectionとかしてるはずですよね? 間違いなく数日たてば controlでも同様に光ってる細胞は減ってるはずですよ。

(無題) 削除/引用 No.2482-2 - 2008/12/11 (木) 14:51:25 - りょう そのベクターに限らず発現量が数日経つと低下していくのは普通ではないでしょうか。 導入細胞が細胞死をおこしていないのなら、なおさらそう思います。

IRES2プラスミドでの強制発現について 削除/引用 No.2482-1 - 2008/12/11 (木) 14:42:52 - むら pIRES2-EGFPを用いてある遺伝子の強制発現系の実験をしています。 transfectionした直後はそれなりに光ってるのが見えるのですが、 数日継代すると、光っている細胞が少なくなっています。 ここで次の場合が考えられます。 １．transfectionした細胞はviablityが落ちていて、 　　継代すると死んでしまう ２．IRES2を用いた強制発現は、数日経つと発現が落ちる。 　　（実はtransfectionされた細胞は残っている） 7-AADで染めると、transfection数日後でGFP(+)細胞は7-AAD(-)ですので、 決してviablityが悪いわけではないようなのですが、 そうすると、２が考えられますが、いかがでしょう？

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