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(無題) 削除/引用 No.2478-13 - 2009/01/17 (土) 16:34:56 - 石川 お返事が遅くなってしまって申し訳ないです！！ とりあえずAmpli TaqのPCR産物を用いて行うことにしました！ さまざまなアドバイスをくれたみなさん、ありがとうございました！！

よく使っています． 削除/引用 No.2478-12 - 2008/12/16 (火) 12:55:18 - mugimaki KOD plus 結構いいのでふだんより使っています． (ver2.0の方ですが・・・) Ampli tag goldではエラーが入るためにこちらの酵素で行っているという 事でしょうか．またprimerのtm値はどのくらいなのでしょうか． Macのamplifyなどでコンピューターを使ったPCRの予測をしてみると もしかするとクローニングした途中にくっつきやすい配列があるのかもしれませんね． 私もこの場合はアニーリング温度を上げて対応しています． kokoメイク様が指摘しておりますように， プラスミドテンプレートのPCRなので，5ngもあれば十分だと思います． 私はいつも0.5ng/tubeで行っております． またprimerの量もマニュアルのよりは少ないです． どうしてもKODでうまくいかない場合はampli tag goldでやったものを 切り貼りして，つなぎあわせて正しい配列にする方法もありますが， 結構手間になったりもするので，最終手段としてとっておいたらどうでしょうか． 色々つらいこともあるとは思いますが，こつこつやってみて下さい．

よく使ってますが… 削除/引用 No.2478-11 - 2008/12/15 (月) 23:09:04 - kokoメイク KOD Plusよく使ってますが、経験的に、添付マニュアルに書かれてある組成よりプライマー濃度下げた方がうまくいく気がします。 プラスミドがテンプレートなら2-5ngでプライマーはマニュアルの半分（以下）の濃度でしています。 アニーリング温度の低めはあまりオススメ出来ないです。 条件検討に時間かけるのももったいないですが、使えるとエラーは入りにくいのでクローニングにはいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2478-10 - 2008/12/12 (金) 17:52:44 - EcoRI ふと、東洋紡のページを見てたら… http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/products/product/pcr/archives/2006/09/kod_plus_kod_plus_ver2.html 上記ページの中程に赤字で >3'側にミスマッチのあるプライマーは、本酵素によって校正を受ける場合があります。 とありますね。とすると… >プライマーの3’末端が3bpくらい浮いている程度ではポリメラーゼ反応は起こってしまうのでしょうか？？ もともとのプライマーが削り込みを受けてしまい、ちょっと短いプライマーができてしまい、 それがミスアニールの原因になってしまっているのかも…

こんな姿勢はいかがなものかと自分でも思います 削除/引用 No.2478-9 - 2008/12/12 (金) 12:15:48 - EcoRI >あと温度は下げてしまうと余計にミスアニールは増えてしまうような気がするのですが。 確かにそうは思いますが、やってみないとわからないのも事実でして… AmpliTaqで、うまくいくなら、KODは忘れてしまってもいいかもしれません。 >あと内側にアニールする部位ですが、プライマーの3’末端が3bpくらい浮いている程度ではポリメラーゼ反応は起こってしまうのでしょうか？？ 3'末端が3 bp浮いてるなら、おこりにくいと思います。 ただ、それはプライマーの他の全ての塩基がアニールしている場合でして、 アニーリング温度が適正でないと、どうアニールするかはわかったものではありません なんと表現したらいいかわかりませんが、 　　__/\___ ______________ みたいに(あぁ、きっと伝わらない)、プライマーが部分的にアニールすることも想定されるわけで… ええと、つまり、うまくいく条件が決まったなら、それでいくことにして、 なぜ上手く行かないのかを検討するのは、余力がある時にする というのが、精神衛生上いいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2478-8 - 2008/12/12 (金) 12:07:29 - ~ >4〜8個のコロニーをとってインサートのシークエンスを読む そうです、いくらlow-fidelityとは言われていても、 サイクル数を落とせばそれほどひどいことにはなりません。 ラボによっては、dNTP濃度を1/4に減らして、 low-fidelityのポリメラーゼでクローニングしていたりします。

ありがとうございます！！ 削除/引用 No.2478-7 - 2008/12/12 (金) 12:01:04 - 石川 みなさん私の初心的な質問にも丁寧に答えてくださって、本当にありがとうございました！！ 今はとりあえずAmpli Taq Gold によるPCR産物を使って進めていて、並行してKOD Plusのほうも考えようかと思っています。 ＞おおさん やっぱりBufferの組成も変わるのでパターンも変わるんですね！ 制限酵素での切り出しやベタインも試してみたいと思います。 ありがとうございました！！ ＞EcoRIさん 丁寧な回答ありがとうございました。 Bufferの組成が変わることがやっぱり重要な気がしました。 あと温度は下げてしまうと余計にミスアニールは増えてしまうような気がするのですが。あと内側にアニールする部位ですが、プライマーの3’末端が3bpくらい浮いている程度ではポリメラーゼ反応は起こってしまうのでしょうか？？ 質問ばかりですいません。。。 ＞~さん つんつんPCRおもしろそうですね！！ぜひやってみたいと思います！ それと4~8クローン読むというのは、4〜8個のコロニーをとってインサートのシークエンスを読むということでよいのでしょうか？？ ＞APさん おっしゃる通り、確かに一回ミスアニールによるPCR産物ができたら、あとはミスじゃなくなりますもんね！！ KODplusの性質ももう一度調べてみようと思います！ また今回はプライマーの濃度もかなり過剰だったので、そこも変えてみたいと思います。 ありがとうございました！！！

(無題) 削除/引用 No.2478-6 - 2008/12/11 (木) 21:38:51 - AP 酵素によって、増幅量や特異性が違う、あるいはうまくいく反応条件が違う ということはあたりまえにあります。 >またノンスペだとしても、ノンスペのほうが圧倒的に濃く出ることはあるのでしょうか？ 正当なターゲットでない配列にパーフェクトマッチでないアニールをしたプライマーからでも伸長が起これば、その産物は末端にプライマー配列を持つことになるので、以後はプライマーがパーフェクトマッチする鋳型になります。両端がこのようになった産物ができれば、普通にPCRがかかってしまうし、短いものほど増えやすいから、目的の産物より短い「非特異的」産物の方が優勢になるのは不思議ではなりません。 とくにPCRのサイクル初期では鋳型に対してプライマーが過剰なので、そういうことが起こりやすいです。一般的には酵素活性も初期の方が高いので（後期ほど失活してくるので）なおさらです。 AmpliTaq Goldは、活性化するのに熱処理が必要で、初期には活性が低くdenature温度にさらされるほど活性が高くなるように工夫されているので（詳しくはメーカーの説明を）、「非特異的」増幅が回避できたのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2478-5 - 2008/12/11 (木) 11:41:40 - - あまり、商品の悪口は言いたくはないのですが、どうもKODはノンスペが出やすく、条件検討が非常に難しい印象があります。High fidelityにこだわるなら、Pfu ultraやPrimeSTARなどのほうが使いやすい印象です。

(無題) 削除/引用 No.2478-4 - 2008/12/11 (木) 10:11:31 - ~ 酵素を変えると増幅パターンが変わるというのは珍しくありません。 目的の増幅が得られないために、他の酵素で目的産物が得られるものを探すという場合はよくありますが、 今回は逆の順番になったのでしょう。 元のベクターのインサート部分を切って電気泳動し、 そのインサート部分をチップでつついたものをテンプレートにしてPCRしてみてはいかがでしょうか。 http://www.biology.tohoku.ac.jp/lab-www/cellbiol/kojinn/oba/1cell.html の02.つんつんPCRです。 非特異の増幅が、ベクターの骨格部分由来であれば、これだけで改善すると思います。 また、2.8kbであれば、Ampli Tag Goldで増えたものを使って、 4~8クローンも読めば、あたりが取れると思いますけど。 KODで条件検討をするならば、平行して進めておいた方が、効率がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2478-3 - 2008/12/11 (木) 10:03:03 - EcoRI 酵素によって、至適バッファー組成が異なりますから、 プライマーのアニーリング温度も変わって来ます。 AmpliTaqでうまくいったアニーリング温度でも、KODではダメなこともあります。 もちろん、酵素の特性もありますが。 温度を上げても変化を認められない、ということですから、 ５０度、もしくは４８度ぐらいまで下げてみては？ >またノンスペだとしても、ノンスペのほうが圧倒的に濃く出ることはあるのでしょうか？ ノンスペというか、ミスアニールだと思います。 目的のDNA領域の内側にプライマーがアニールしてしまう領域があるのでしょう。 それはよくあることです。 プライマーの設計を見直す(30bpぐらいまで長くするとか)ことも手だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2478-2 - 2008/12/10 (水) 23:56:53 - おお >[Re:1] 石川さんは書きました : > Ampli Taq Goldで53℃で見えていたものが、KODPlusの53℃で見えなくなることはあるのでしょうか？ > またノンスペだとしても、ノンスペのほうが圧倒的に濃く出ることはあるのでしょうか？ > 酵素によって極端にノンスペのパターンがかわることも まあありますね。 KODplusとかだとベタインを使う方がうまく行くことが 多いと思えます(個人的な感想ですが)。 あとは鋳型のプラスミドから、目的の領域を含む(なるべく) 最小領域を制限酵素で切り出してテンプレートにしてみるとか、、 ノンスペはともかく、必要なDNAが増幅されていればそこを 切り出せば何とかなるので、条件検討にあまりはまらない ほうが得策とおもえます。

KOD plusでのＰＣＲ 削除/引用 No.2478-1 - 2008/12/10 (水) 23:05:44 - 石川 私は今、目的のDNA(約2.8kb)を発現ベクターにのせて人の細胞で発現させようとしています。 そこで目的のDNAが含まれているプラスミドを鋳型とし、発現ベクターにのせかえられるようにプライマーの5´側に制限酵素サイトをつけたプライマーを用いてPCRをかけています。 いろいろと事情がありまして、はじめはA&B社のAmpli Tag Goldを用いました。 そしてその時は電気泳動にてだいたい2.8kbの位置にバンドがでました。 次に同じプライマーを用いて今度はTOYOBOのKODplusでやってみました。 すると目的の位置にもぼやっとバンドは見えるのですが、1.7〜1.9kbの位置にそれよりもかなり濃いノンスペが出てしまいました。 アニーリング温度は、Ampli Tag Goldのときはを53℃でやっていまして、300bp付近にノンスペが出ているだけだったのでKODplusでも同じ温度で行いました。 一応58℃にあげてKODplusで行いましたが、あまり変わりませんでした。 Ampli Taq Goldで53℃で見えていたものが、KODPlusの53℃で見えなくなることはあるのでしょうか？ またノンスペだとしても、ノンスペのほうが圧倒的に濃く出ることはあるのでしょうか？ 初めて書き込むのでわかりにくいかもしれませんが、 わかるかたどうかよろしくお願いします。

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