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(無題) 削除/引用 No.2475-4 - 2008/12/11 (木) 23:51:19 - bigpig 直接の回答にはならないと思いますが。 あと、どのぐらいのところにバンドが出ているのかわかりませんが。。。 ２０００bpぐらいのところでしょうか？ 僕もpGWBシリーズのベクターを使ったことがありますが、たまにバンドが２本出るものがあります。Gateway系のベクターは何回か２本バンドが出たことがあります。そーゆー時は他のクローンを使うようにしています。 そのまま形質転換に使ったこともありますが、特に問題はありませんでした。 気持ちが悪いので、２本バンドが出たものはストックにはしませんでしたが･･･ 先に書かれている人がおっしゃっているように、制限酵素で切って判断をするべきです。たまにPCRで増えても制限酵素で切れないことがあります。 確か、Xba�TとSac�TかHind�Vで切れるのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2475-3 - 2008/12/10 (水) 12:38:10 - おお 精製したプラスミドはもしリニアライズをしていなかったら、 スーパーコイル、ニックのはいったオープンサーキュラー、直鎖状の３種類が みられます。スーパーコイルは直鎖より低いところに来るのがたいていで、 巻数によっても移動度が違います。 たまにプラスミドが鎖のようにつながった(といっても2、3分子でしょうけど) ものが高分子側に見られることがあるそうです。 もし、制限酵素で切断していないで見ているのであれば、切断して 理屈通りに切れるか見られた方がいいです。 もし切ったのにそういうことが起こるなら、いろいろな原因が ありますので、少し具体的に問題を提示された方が いいと思います。

http:// 削除/引用 No.2475-2 - 2008/12/10 (水) 11:21:52 - TK-1 > 得られたプラスミドの溶液を空ベクターと一緒に電気泳動にかけたとこら、空のベクターのバンドの近くにとれたプラスミドのバンドが見られたほか、コロニーによっては別のバンドを２本見られました。見た目はsupercoiledとnikeの入ったプラスミドらしいのですが、分子量はかなり小さいです。supercoiled プラスミドと思われるバンドが非常に濃かったです。 泳動前にもちろん何かの酵素で切っているんですよね。切らないで流してサイズがどうこうといいたいのであれば、もう一度教科書から読み直した方がいいと思います。

pGWBの精製時に生じる未知なバンドについて 削除/引用 No.2475-1 - 2008/12/10 (水) 10:50:01 - てんてん ある遺伝子のプロモーター領域の機能を調べるため、pGWBで発現ベクターを作っています。 エントリークローンからLR反応を行い、pGWB３にプロモーター配列を入れて、大腸菌に入れました。株はDH５αを使いました。 シャレーにまいて、出てきたコロニーをピックアップし、ナカライのplusgrowという培地で１６時間震盪培養を行い、Mag extractor plasmid extraction kit (Toyobo)でプラスミドを精製しました。精製は手動で行いました。 得られたプラスミドの溶液を空ベクターと一緒に電気泳動にかけたとこら、空のベクターのバンドの近くにとれたプラスミドのバンドが見られたほか、コロニーによっては別のバンドを２本見られました。見た目はsupercoiledとnikeの入ったプラスミドらしいのですが、分子量はかなり小さいです。supercoiled プラスミドと思われるバンドが非常に濃かったです。 PCRをすると、どれも増えました。（プライマーはインサートのものですが） いつもこのキットを使って、プラスミドの精製をしているのですが、このように大腸菌ゲノム等由来のもの以外で、未知なバンドが出てくるのははじめてです。 バンドは何者か、原因はなんなのか、よくわからないので、ここでご意見等頂けたらと思います。 よろしくお願い致します。

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