BioTechnicalフォーラム [リン酸化をウェスタンで確認-サイズが近いバンドを検出するには-]

リン酸化をウェスタンで確認-サイズが近いバンドを検出するには-

No.2462-TOPIC - 2008/12/08 (月) 23:44:47 - るる２

培養細胞を刺激してリン酸化し、どの程度リン酸化されているかをウェスタンで確認しようと思っています。

既に培養細胞を刺激して、リン酸化がおこっていることは特異的な抗体を使用したウェスタンで確認しました。
目的の蛋白はリン酸化した場合に、ウェスタンでマイグレーションしたバンドとして二重にみえます（published paperでは）ので、リン酸化前のバンドとリン酸化後にマイグレーションしたバンドでどの程度リン酸化されているのかをおおまかに知る事ができます。

知りたいのは、目的の蛋白がどの程度リン酸化されているか、ということです。
しかしバンドが近すぎて（目的のバンドは両方とも75-90KDa付近）通常のミニゲル８％では
なかなか分離したバンドを認める事ができません。
そこで質問なのですが、近いバンドをウェスタンで検出しようとするときに、どのようにしたら
いいでしょうか？

ちなみに私は今まで、刺激した細胞をラムリーバッファー（サンプルバッファー）に溶かし込み、ボイルしたものを８％のミニゲルにローディングし、80Vくらい4℃でゆっくり数時間かけてrunningし、目的の抗体でウェスタンを行いましたが、はっきりとした２重のバンドを得る事ができませんでした。最初にいいましたが、このサンプルがリン酸化しているのは特異的な抗体で既に確認済みです。

次にやることといえば、大きなGelで長時間４℃でrunningも考えていますが、サンプルが残り少ないので、確実に二重のバンドが見える方法を取りたいと考えています。
どなたか似たような実験を経験された方、またアドバイス等いただけますと幸いです。
よろしくお願いいたします。
　

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No.2462-10 - 2008/12/12 (金) 02:29:53 - おお

>[Re:9] るる２さんは書きました :
> 質問者です。
> 皆様のアドバイスどうもありがとうございます。
> 予算の関係もあり、大きなゲルでゆっくり電気泳動して
> リン酸化のバンドを検出することにしました。

おめでとうございます。よかったです。
そういえば、私の知り合いもそういう時は大きいゲルで
ながしていました。いまさらですが、、、、

大きなゲルで２重バンドみえました。

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No.2462-9 - 2008/12/12 (金) 00:30:02 - るる２

質問者です。
皆様のアドバイスどうもありがとうございます。
予算の関係もあり、大きなゲルでゆっくり電気泳動して
リン酸化のバンドを検出することにしました。

８％のSDS-PAGE GELを４℃でover night電気泳動して
ブロッティング、ECLで確認したところ
（完璧ではありませんが）２重のバンドが見えました！

みなさまご回答ありがとうございました。
機会があればリン酸化用のゲルも試してみたいと思います。

(無題)

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No.2462-8 - 2008/12/09 (火) 11:35:00 - 通りすがり

対象とするタンパクにもよりますが、ERK(哺乳類MAPK)などについては
bisの濃度(％C)を下げたlow-bisの(large) gelを用いてリン酸化を定量しています。
SDS化した後でも立体構造が残っているために、バンドが二つに分かれるという理屈だったかと思います。
汎用性では2Dには敵わないもしれませんが、余計な手間がかからないのが気に入っています。

ラボの先輩によると、Phos-tagを使うとバンドが元よりもスメアになることがあるという話でした。
これも対象とするタンパクの性質に大きく依存するとは思いますが、念のため。

いずれの方法をとるにせよ、予備実験をされるほうがよいかと思います。。。

IEF

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No.2462-7 - 2008/12/09 (火) 09:29:16 - tx

私は、IEF用のゲル（2次元でいうとこの2元目のゲル）をバイオラッドから買って検出しています。大変シンプルです。SDS-PAGEで目測で違いがでるなら、IEFだとかなり差がでると思いますよ。フォスファターゼでプレ処理してコントールを設けても良いかもしれません。

(無題)

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No.2462-6 - 2008/12/09 (火) 08:47:50 - おお

>[Re:2] おおさんは書きました :

> または、アクリルアミドをモディファイしたもので、

>[Re:4] あべちゃんさんは書きました :
> リン酸化蛋白質の泳動度が変わるこんな試薬があります。
> http://www.phos-tag.com/shouh/index.html#acrylamider
>
> リン酸化蛋白質の泳動度を変化させるそうですよ。

あ、多分これだ。あべあべちゃんさんが情報源だったんですね。

(無題)

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No.2462-5 - 2008/12/09 (火) 07:22:49 - あ

以前リン酸化をウェスタンで見ていましたが、大ゲルで十分見れていましたよ

(無題)

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No.2462-4 - 2008/12/09 (火) 01:15:47 - あべちゃん

リン酸化蛋白質の泳動度が変わるこんな試薬があります。
http://www.phos-tag.com/shouh/index.html#acrylamider

リン酸化蛋白質の泳動度を変化させるそうですよ。

(無題)

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No.2462-3 - 2008/12/09 (火) 00:00:04 - おお

あと、ゲルのバッファーの選択肢もいまはありますね。
BIS-TRISを確か使って中性で電気へいどうというのも
いいかもしれません。pHでタンパクの電荷のバランスが
変わってきますから。
いずれにせよ何か予備実験ができるようなサンプルを
調せいできないですかね、、