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(無題) 削除/引用 No.2453-11 - 2008/12/12 (金) 09:07:43 - おお ですが、真核生物のばあい、ERで合成されるタンパクが 修飾されるケースが圧倒的に多く、そういうタンパクには N-リンクとO-リンク型があります。 細胞質ではそういうのは少なく、たしかO-リンク型が見つかって いたと思います(SP1とか)。ですのでどこに発現させたか によって考慮の仕方も変わってくるのではないでしょうか、、 そのタンパクを分泌させようと思っているのでしょうか、、、 このフィールドは今あまり関係ないので、かないあいまいですが どなたか詳しい方、間違っていればフォローお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2453-10 - 2008/12/11 (木) 22:11:11 - ザンギ あいかわらず回答になってませんが．．． 糖鎖修飾ときまったわけではないですが．．．． AspではなくてAsnですよね。 既報の論文にこだわっておられますが、PUBMEDやGoogle Scholarなんかで文献検索すれば、おそらくコピー仕切れないほどの数がヒットすると思います。 それを片っ端から読んでいっても、解決法にあたる確率はほとんどないと思います。 勉強したいんであれば教科書レベルの問題ではないでしょうか。 おおさんがいろんなヒントを教えて下さっていますが、私からは、 御自分の実験結果をよく吟味されることをおすすめします。 解決の糸口はそこにしかありません。 バクテリアがつくるタンパク質と酵母がつくるタンパク質で電気泳動上の移動度が微妙に違っていたり、テーリングしていたり違いがありませんか？ 隣合わせで電気泳動しないと違いがわからないくらい微妙なちがいかもしれません。 まずはそこから確かめてみて下さい。

(無題) 削除/引用 No.2453-9 - 2008/12/11 (木) 15:12:27 - おお いろいろと活性がでない理由の可能性があると思いますが、 その酵素のコファクターなども考えないといけないかもしれません。 コファクターといっても多様で金属イオン、ビタミン、ヘム、フラボノイド などの比較的小さいケミカルや場合によってはRNAなど(シグナルペプチド を認識するたんぱくはRNAを持っていたと思います)多彩ですし、 ほかのタンパクとヘテロダイマーをとるが、そのこと自身がはっきり 分かっていないなんていう可能せいもあるかもしれません。 大腸菌のライセートと酵母のライセートを混ぜることで、活性化 するとかないでしょうか?そうすると糸口がつかみやすいと思います。 上記のように酵母が持ってないコファクターが必要か、 大腸菌にしかないタンパク修飾が必要ということも あり得るかと思います。大腸菌ではヒスチジンが燐酸か されることがあるようですし。 あとは、実はその物質が代謝されるのはその酵素の活性だけで はなく、多段階でその前にもう一段階何か作用しないといけない けど、現状１段階と思われているため、反応が進まないとか、、 (これは考えスギかもしれませんね) ま、好き勝手に想像をめぐらせているだけなので、 参考になるかどうか分かりませんが。

(無題) 削除/引用 No.2453-8 - 2008/12/11 (木) 13:38:45 - Mi >ザンギさん 翻訳されれば活性がなくても「発現された」というものだと思ってました。理解不足で申し訳ありませんでした。 Asp残基の置換ですか。SerとThrにも糖修飾がありますよね。どのあたりが修飾されるものなのでしょうか。 それと少し思いついたのですが、目的の酵素を精製し、修飾された糖を切る酵素にかけてから活性測定してみるといいかもしれないですね。活性の低下が糖修飾によるものかどうかが判定できるかな、と考えております。 >おおさん このようなトピックの立て方にも関わらず、ご親切にご回答いただきありがとうございました。 引き続き、今回のケースのような異種遺伝子発現について何かご存知のことがありましたら教えていただきたいです。どうぞよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2453-7 - 2008/12/10 (水) 19:13:49 - ザンギ そうそう、さらに駄レスですが、 「何かの遺伝子が発現する」と記述した場合に、その遺伝子がなにかの酵素をコードしているのなら、酵素活性の発現を持って遺伝子発現とするのが本来的な意味です。 発現には各ステップがあって、転写、翻訳．．．ですね。 なのでMiさんの表現では曖昧さが残ってしまって、おおさんのように親切な対応をして貰えないと、回答がつきにくいんです。 言葉は大事ですね。

(無題) 削除/引用 No.2453-6 - 2008/12/10 (水) 19:09:52 - ザンギ 駄レスですが、 翻訳までは行ってるんでしたら、翻訳後修飾かフォールディングかの問題ですよね。 修飾されてるんでしたら、電気泳動上で移動度が違ったりする場合も少なくないでしょう。解決法はとりあえず糖鎖のつきそうなAsnを置換してみる。 フォールディングについては、バクテリアのシャペロンが必要な場合もあります。バクテリアの遺伝学研究からなにか参考になる知見があるかもしれません。 異種遺伝子導入って、非常に各論的なので前例は勉強にはなっても決め手にはならないでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.2453-5 - 2008/12/10 (水) 18:08:35 - Mi >発現の確認はウエスタン(タンパク)ですか?RT-PCRですか? ウエスタンです。きれいなバンドが見られたので、発現はしています。 >活性がないのは酵母が目的のものを産生しないからですか、ライセートをとったりして、活性を調べたけどなかったということですか。 両方です。活性測定の方法には問題ないはずです． ですから、酵母で合成された酵素自体に活性がないと考えています。 大腸菌では活性があるのに、酵母では活性がありません。 これは酵母の細胞内の何らかの事情によるものではないかな、と考えています。 真核生物の遺伝子を大腸菌をはじめとする原核生物に入れて発現させるための試み、というのはOrigamiのようなコンピやpcoldのようなベクターの工夫などいろいろ聞いたことがあります。 しかし、逆の場合である原核生物の遺伝子を真核生物に入れ、その酵素の活性がなかった場合にどのようなアプローチをとって活性をあげればよいのか、聞いたことがありません。 糖修飾かなにかが問題になっているのでは、と考えていますが・・・ 過去に上記のような問題を解決したような研究例などがありましたら紹介していただきたく、今回投稿させていただきました。

(無題) 削除/引用 No.2453-4 - 2008/12/10 (水) 12:53:15 - おお >[Re:3] Miさんは書きました : > ご指摘ありがとうございます。 > > ある物質を酵母を使った発酵法で作りたいと考えています。 > そのための大腸菌の遺伝子を酵母に導入しました。発現はしましたが、活性がほとんどない状況です。 発現の確認はウエスタン(タンパク)ですか?RT-PCRですか? もしかしたらコドンユーセージの違いで発現量がひくい ということもあるかもしれません。 活性がないのは酵母が目的のものを産生しないからですか、 ライセートをとったりして、活性を調べたけどなかった ということですか。酵母で合成されたタンパク自身 に活性があるのに、酵母でそれが機能しないのと、 酵母で合成されたタンパク自身に活性がないのでは 大きな違いです。 期待する産物は、酵母の代謝も利用して作るのですか? それとも、あなたの発現させた遺伝子で1スッテプで 合成されるのですか? もし酵母の酵素も必要であれば、その局在も関係してくる かもしれません。 同時にその原料になる物質が酵母のどこに蓄積するか というのも考慮が必要かもしれません。

遅くなって申し訳ありません。 削除/引用 No.2453-3 - 2008/12/09 (火) 20:34:32 - Mi ご指摘ありがとうございます。 ある物質を酵母を使った発酵法で作りたいと考えています。 そのための大腸菌の遺伝子を酵母に導入しました。発現はしましたが、活性がほとんどない状況です。 原核生物の遺伝子を真核生物に導入するとよくこういう問題が起こると思いますが、どうやったら活性を上げることが出来るのか、思いつきません。 活性が落ちないように変異を入れたり、他にも遺伝子レベルなどで工夫して酵素活性を上げることに成功した論文があれば教えて頂きたいのですが。。。 よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2453-2 - 2008/12/08 (月) 16:38:13 - おお もう少し具体的に(できる範囲でいいですので)書いた方がいいかと、、 発現させて、、、、何するんでしょうか。 精製?酵母の様子を観察する? 酵母になにか起こると考えているなら、期待されるフェノタイプ は、、、、、 なにか2ハイブリッドみたいな、アッセイ系を作るとか、、、 多分アドバイスがケースバイケースで違ってきますので、、、

酵母での発現に関する論文 削除/引用 No.2453-1 - 2008/12/08 (月) 11:44:44 - Mi 初めまして。 大腸菌の酵素を S. cerevisiae で発現させようと考えています。 何か参考になる論文などがありましたら教えて頂けませんでしょうか。 よろしくお願い致します。

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