ゲノムのPCRでありがちな(初心者にとって意外に思える)ミスはDNAが多すぎることです。反応溶液に10ngあれば十分です。多くても50ngくらいでしょうか。
いままで多すぎてかからないというのを何どもみてきました。
あとはポジコンが取れないでしょうか?ひとつは、もしゲノムのPCRでほかのDNAが増幅できるかです。あなた自身、またはあなたの研究室で使っていてワークするプライマーセット(ターゲットはなんでもいいとおもいます)でPCRがかかるかどうか。
PCRの反応系か得られたDNAに問題があるのであればそういうポジコンをとってもかからないですから、原因の絞り込みができます。
もう一つは、ターゲットの配列がプラスミドなどに入ったものとかで、大体条件の許容範囲を知ることができると思います。
もし目的がその配列をプラスミドにクローニングするのであれば、その配列を含むファージやBACなどてに入れるのもてかと思います。
ここでカナマイシンさんが言っていたのですが、ターゲットのPCRをかける領域を切らない制限酵素で切断して、アガロースげるで分離して、だいたいターゲットが含まれるサイズの部分を切り出して精製してからPCRをかけるというのも有効かと思います。
目的の配列の外側のプライマーで増幅してからさらに今のプライマーで増幅するといった方法もあります。
目的がクローニングでなくて、PCRの系がOKであれば、条件を動かしていかなければいけないのですが、そのまえに、プライマーを設計しなおすというのが
意外に早道だったりすると言うことを、頭の片隅にでも置いておいてください。
60度のアニーリング温度と言う事はプライマーは25マーくらいでしょうか。それぐらいならなんとかなるかと思いますが、私の場合は30マーに近いぐらい
のながさでやりますね、ゲノムの場合は。
スタートとして妥当な温度であるかもしれませんが、まず温度をどんどん下げていきます私の場合は長さによりますが50度位まででしょうか、、、
ノンスペが出ても良いからバンドがでるまでという感じです。でも実をいうと下げてもかんばしくない場合、バンドが出なくても上げた方がいい場合があるのも事実です。
ターゲットのスペシフィックなバンドいがいにもノンスペが出て、邪魔になる時は、その段階でその条件でDMSOやベタインを加えるとか、ゲノムだとタッチダウンを試すとかということを考えます。私はマグネシウムはいじりません。
私は実際条件検討よりも酵素をかえることのほうがおおいです。Taqのほか、ExTaqやLAtaq, Pfu、KOD、ピロベスト、、、最近タカラがさらにフィデリティーの高いものを出したようですし。
まずはラボにほかの酵素やメーカーの違う物があればそう言うのを試してみるといいとおもいます。 |
|
このスレッドをはてなブックマークに追加