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(無題) 削除/引用 No.2442-3 - 2008/12/05 (金) 09:48:24 - ~ Phusionで増やした後でダイレクトシークエンスを行っていました。 100~200bp読めればいいという操作だったので、長い場合の影響は分かりません。 安全策をとりたいのでしたら、カラム精製の方が間違いは無いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2442-2 - 2008/12/04 (木) 23:19:22 - ザンギ シーケンスの鋳型に使う量ならファイナルで1/100くらいでしょうから、問題になるような組成変化ではないように思いますが。

ダイレクトPCR反応液のシークエンス反応への持込 削除/引用 No.2442-1 - 2008/12/04 (木) 20:54:26 - あいうえお 古いトピックを起こして、申し訳ありません。 皆さんの中でご経験ある方いらっしゃいましたら、お考えを お聞かせいただけませんでしょうか？ いま、血液からPhusion Direct Blood Kitを用いて 単一のDNAフラグメントを得ることができました。これを ダイレクトシークエンスする予定です。 ただ、Phusionのkitは、α系ポリメラーゼを用いていると思いますので、 3'->5'エキソヌクレアーゼ活性がPCR後の溶液にも結構残っているように 思います。 この溶液を例えばExoSapIt処理した後、シークエンスをしても、 ddNTPがとりこまれたDNAフラグメントを得ることができないのでは ないだろうか？とふと思いました。 それならば、ExoSapItを購入せず、カラム精製した方が 手間はかかりますが安全策かなーと思ってみたりもします。 このようなシステムでダイレクトシークエンスを行っている方が いらっしゃいましたらご体験や、こうおもうぞ！などなんでも 結構ですので、お考えをお聞かせくださいませんか？

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