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(無題) 削除/引用 No.2439-4 - 2008/12/05 (金) 15:35:54 - Help 早速の返答ありがとうございます。 ~ さん情報不足ですみませんでした。 DY380とStbl4の力価は測ったことはありませんが、5mlのリキッドで、30℃、O/Nカルチャーしたものをカラムを使わずにプレップし、30μlのdH2Oに溶かしています。 DY380の時は、コンピ50μlに対して8μl加え、コロニーは10〜50ぐらいです。 Stbl4はコンピ40μlに対して3μl加えてコロニーは10個ぐらいです。 エレポの条件は1750V、200Ω、25uFで回復培養は90min、30℃でしています。 それを、Amp or Cmのみのプレートにまき、30℃で培養しています。また、 マスタープレートに移す際に、ブルーホワイトセレクションとBACのもつ耐性遺伝子をすべて入れたプレートでセレクションすると生えてきても、はずれか、ほとんど生えてこない状況です。 それぞれの薬剤濃度は Amp50μg/ml Cm12.5μg/ml Kan25μg/ml Zeo 25μg/mlです。 また、DY380からStbl4に移すのは、その後に細胞にトランスフェクションするためで、BACをトランスフェクションする条件はまだ決まっておらず、どれだけ必要かは検討中です。また、そのときに安定株で大量培養したいために、Stbl4にトランスフォーメーションしようとしています。 BAC使用者さんへ ありがとうございます。それを試してみたいと思います。

できるかどうかわかりませんが・・・ 削除/引用 No.2439-3 - 2008/12/05 (金) 13:54:45 - BAC使用者 BACを扱っている者です。 組替えがきちんといっているとして 抗生物質の濃度を落とし、37でo/nしたあと室温で2日待ってみてください。私の場合はこれで小さなコロニーが生え、全てあたりでした。 最初に生えてくるやつはスカが多かったです。

(無題) 削除/引用 No.2439-2 - 2008/12/05 (金) 12:17:52 - ~ DY380とStbl4のタイターはどのくらいなのですか？ それぞれに何ngずついれて、DY380ではどのくらいのコロニーが生えているのですか？ 何のためにDY380からStbl4に移そうとしているのですか？ 必要量をDY380で増やすためには何L必要なのですか？

Stbl4へのTransformation 削除/引用 No.2439-1 - 2008/12/04 (木) 17:22:18 - Help 今、私はDY380でのBACの組み換える実験を終え、大腸菌の安定株であるStbl4に組み換えたBACをTranformationの実験をしています。 しかし、Stbl4のプロトコールにしてもコロニーが10数個しか生えず、全部がはずれであったり、BACのDY380の調整のようにＳtbl4を調整してもコロニーが生えてきません。 BACの調整法が悪いのかも知れませんが、何でもいいので情報がありましたら教えてください。

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