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ありがとうございます。 削除/引用 No.2436-8 - 2008/12/07 (日) 11:39:15 - wakuhei 免疫屋様、おお様、そば様　ありがとうございます。 免疫屋様 実は私の以前いたラボでは、QiagenのオンカラムDNAse処理を行っていました。発現量の低い遺伝子で、なおかつ、プライマー間に挟んだイントロンの長さが短い場合のみ、ゲノム由来のバンドがでましたが。殆どの場合問題ありませんでした。 おお様 たしかにRNeasy plusにはゲノムDNA除去用のカラムがついています。どんなメカニズムかご存知でしたらお教えください？使ってみたいのですが、古いRNeasyを使い切ってからと思い、まだ試していません。 そば様 QuantiTect Rev. Transcription Kitのマニュアルを読んだところ、予備実験が必要そうだと感じました。特にTemplateの量、DNA分解の時間でゲノムDNAの残留量が変化しそうです。ゲノムとcDNAの両方増幅できるリアルタイム用プライマーを持っていますので、DNAse処理条件によるゲノムDNA残留の違いを調べた上で本実験に用いようと思っています。

(無題) 削除/引用 No.2436-7 - 2008/12/07 (日) 03:36:58 - そば QIAGENのQuantiTect Rev. Transcription Kitは逆転写反応速度が速く、プライマーもランダムとdTの混じった特別仕様なので、RealTimePCRに用いる分にはなかなか良いキットだと思います。しかも”一応は”DNase処理付きですからね。 が、この”一応”が曲者。 キット通りの反応系で本当にDNAが完全に消化出来たのか不明である点と、それを確認しようにも反応bufferの添付量が少ないという点が、私はあまり好きになれないところですね（要するに、RT-の実験を考慮したキット構成になっていない）。反応バッファーも粘性が高く扱いにくいですし。 私個人の評価としては、このキットを使う場合はやはりイントロンを間に挟んだプライマーを用いる方が無難、だと思います（そういう系で用いれば優秀なキットと言えます）。 DNaseはTAKARAを愛用中。これくらい一般的な酵素くらいは国産で！ （以前どこかで書いたと思いますが、独自の反応バッファーを用いれば優秀） ただ、精製済み微量RNAということでしたら、Pumpkinさん同様、Ambion（ABI）のTURBO-DNA-freeをお薦めしておきます。細胞から回収し直すならカラム系の方が良いですが。

(無題) 削除/引用 No.2436-6 - 2008/12/06 (土) 16:46:25 - おお オンカラムで消化するタイプと、 DNase処理なしでもDNAのコンタミが防げる 精製キットが各社から出てますね。 キアーゲン、アジレントなどでしょうか、、

(無題) 削除/引用 No.2436-5 - 2008/12/06 (土) 05:48:22 - 免疫屋 僕は基本的にQiagenのRNeasyでRNA分取時にon column digestionにてDNase処理してます． 微量RNAも効率よく取れますし，DNaseを失活させる必要もありませんから（余分なロスも防げることも含めて）便利ではあります．

ありがとうございます 削除/引用 No.2436-4 - 2008/12/05 (金) 06:24:20 - wakuhei Pumpkin様、おお様　ありがとうございます。 Webで調べてみました。Promegaの酵素で処理して再度Trizolで処理するとRNAの純度が向上しそうに思いましたが、私の技術ではフェノール抽出＆エタ沈の回収率は7〜8割程度です。RNAがわずかしか取れてないため今回はできないかもしれません。ABIのキットはDNA不活化後、精製せず実験に使えるので便利そうです。精製ステップがないので、自分のRT-PCRの条件にキットの溶液が影響を及ぼしているかの確認を購入した際に行おうと考えています。 ありがとうございました。他の方からの意見も聞けると良いので、今しばらく解決にチェックはつけないままにしておきます。

(無題) 削除/引用 No.2436-3 - 2008/12/05 (金) 01:59:26 - おお RT用であれば、そんなにどこも変わらないようなき がしますが、一応プロメガといっておきましょう。 DNase1はMnの存在下でダブルスとランドブレイク を起こすといわれています。Mg/Ca存在下でも 活性があるのですが、シングルスとランドプレイク (2本鎖の一方しかきらない)です。前者のほうが PCRをかける時にバックを拾いにくいと思いますし、 プロメガには、それがしっかり明記されています。 他社のバッファーを調べたことは ないので、他社がMnを使っているか 分かりません。

I like Ambion. 削除/引用 No.2436-2 - 2008/12/04 (木) 19:59:20 - Pumpkin AmbionのTURBO-DNase単体もしくはTURBO-DNA-freeを使ってます。TURBO-DNaseはDNAへの結合能力を高めてあり（リコンビナント）、キットでは分解能が600倍になっているとうたっています（残念ながら厳密な比較はしたことありません。うたい文句にのせられてます。しかし、いままでもんだいになったことはありません）。 50rxnで\16000なので、高くないと思います。キットがいやなら単体でもあありますし、普通のDNase1も売っています。DNase1も使っていますが、ちゃんと分解してくれていますよ。 候補の１つにどうぞ。

おすすめのDNAseは？ 削除/引用 No.2436-1 - 2008/12/04 (木) 12:33:34 - wakuhei 精製済みのmouse T-cell RNAからgenomic DNAを除こうと考えています。私がいるラボでは、primerの設計でゲノムDNAの影響を回避していたため、誰もDNAseを使っていません。今回、RealTime RT-PCRを行うことになりましたが、使用するプライマーがゲノムも増幅するため、事前のDNase処理が必要になりました。 以前、聞きに言ったリアルタイムPCRのセミナーで、ゲノムセンターの先生がキアゲンのQuantiTect Rev. Transcription Kitを一押ししていました。このキットを使っている方がいましたら製品のご評価を、また精製微量RNAサンプルからDNAを除いている方はお勧めのDNA除去方法をお教えください。 よろしくお願いします。

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