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(無題) 削除/引用 No.2435-10 - 2008/12/09 (火) 20:32:36 - もどかしい PCRで解決しました。 皆様ありがとうございました。

ありがとうございます 削除/引用 No.2435-9 - 2008/12/04 (木) 17:18:31 - もどかしい 皆様色々とありがとうございます。 それが・・・次に乗せかえるベクターが曲者すぎて脱リン酸化ができないんです。 申し送れましたが【大きなサイズのベクターのクローニング】でお世話になった者です http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?start=21;mode=view;Code=1928 とりあえず、PCRと、バンドを両方切り出して虱潰しにクローンを取る方法の二つで検討をしてみたいと思います！ ご指導ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2435-8 - 2008/12/04 (木) 16:28:59 - EcoRI >ところでPCRは2kbを一気にかけても大丈夫でしょうか・・・ ハイ・フィデリティのpolymeraseでエクステンションを3分とれば、大丈夫ですよ エラーが気になるところですが、 移し替えた後、シーケンスを調べればエラーは弾けるので問題ないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2435-7 - 2008/12/04 (木) 16:22:11 - ~ 脱リン酸化は当然と思っていたので書いていませんでした。 >ところでPCRは2kbを一気にかけても大丈夫でしょうか・・・ 私ならば、10サイクル以下くらいで一気にかけます。

ありがとうございました！ 削除/引用 No.2435-6 - 2008/12/04 (木) 15:50:06 - もどかしい 皆様レスありがとうございました。 たくさん提案いただいたのでいずれかの方法でやってみようと思います。 色々やり方があるのですね！頭が固まっていたみたいです。 ところでPCRは2kbを一気にかけても大丈夫でしょうか・・・ それとも、1kbぐらいを2回やった方がいいでしょうか。 解決したらまた来ます！

(無題) 削除/引用 No.2435-5 - 2008/12/04 (木) 12:50:43 - おお ほとんど指摘があるので重なっていると思いますが、 ベクター内にある制限酵素認識配列で、インサートにないもので ベクターをきる。そうすると多分切り出せると思いますし、 切り出せなくても、インサートの末端とコンパティブルで なければ大丈夫だとおもいます。念のため脱燐酸かしておけば なおいいと思います。 脱燐酸かをして、もとのベクターとライゲーションがかからないように する。 PCRでインサートを増幅し、DpnI処理などで、ベクター、ベクター由来 のインサートが交じらないようにする。 違う抗生物質のマーカー(バクテリアにたいする)をもったベクターに移す。 粘着末端がコンパチブルだけど、違う制限酵素で、次に入れるプラスミド を処理する(利用可能なら)。例えばXho1できりだして、Sal1サイトにいれる のであれば、ライゲーション後Xho1できると、Xho1-Sal1のライゲーション だけのこる。ん、これは粘着末端だけでなくてもいけますね。 ちがう酵素であればプラントでもOKです。 理屈のうえではまだ他にもありますが、現実的なのはこんなところ とおもいます。

(無題) 削除/引用 No.2435-4 - 2008/12/04 (木) 12:21:47 - AP 切り出さないで脱リン酸して、脱リン酸していないベクターとライゲーションする。脱リン酸するのはオリジナルのベクターにインサートが戻らないようにするため。コロニーをスクリーニングして目的のインサートをもつものを見つける。 加えて二重切断したあとオリジナルベクターに切断可能なクローニングサイトが残っているようなら、それで消化しておく。これによって、オリジナルのベクターは、インサートや新しいベクターとフィットしない末端になるので排除できる。これを切り出ししないで、上記のように脱リン酸してライゲーション。

(無題) 削除/引用 No.2435-3 - 2008/12/04 (木) 12:08:35 - ~ ベクターとベクターアームの関係がよく分かりませんが。 １．ベクターアームのみを切れる制限酵素を買う(2kb中に1個も制限酵素サイトが無いとは考えにくいです) ２．インサートを半分位に切って、それぞれを回収する （3ピースライゲーションか、sequentialに行うかは状況次第） ３．インサートとベクターアーム両方まとめて切り出し、ライゲーションして、当たりのコロニーをコロニーPCRなどで選ぶ ４．PCRでインサートを回収する 状況によって使い分けます。

間違えました 削除/引用 No.2435-2 - 2008/12/04 (木) 11:52:51 - もどかしい ×　2kbのベクターがあり ○　2kbのベクターアームがあり、 　　つまり計4kbで切断すると2kbと2kbになるということです

バンドが重なるクローニングについて 削除/引用 No.2435-1 - 2008/12/04 (木) 11:48:27 - もどかしい 単純なことなのですが、煮詰まっています。 よろしくお願いします。 2kbのベクターがあり、インサートを二重切断で別のベクターに移し変えるだけの単純な作業です。ですがインサートは2kbです。 ベクターアームの中に、制限酵素サイトはありません。 結果、2本のバンドが同じ位置にきて見分けがつかず切り出せません。 この場合、皆様ならどうしますか。 お知恵をかしていただければと存じます。

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