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(無題) 削除/引用 No.2430-9 - 2008/12/10 (水) 15:58:17 - 名無し butyrateの条件あった。5mMだった。100%コンフレンシーの細胞で24時間。細胞とくに死んだりとかはないけど、増殖は阻害かかるらしい。ウェスタンでのヒストンのアセチル化のシグナルはコントロールの５倍くらいまで増える。

(無題) 削除/引用 No.2430-8 - 2008/12/08 (月) 18:08:53 - ヒストン そうですか・・・やはりコンフレント後ではだめですかね。 とりあえず、コンフレント後にTSAまたはbutyrateをかける方法でウエスタンやってみようかと思います。 もし、「コンフレント後に投与してもだめだった！あるいは大丈夫だった！（アセチル化が起こった）」という経験があるかた、何か教えていただけることありましたら、お願いします

(無題) 削除/引用 No.2430-7 - 2008/12/04 (木) 21:28:37 - アッチ コンフレントになってからでは、効果ないのでは？

(無題) 削除/引用 No.2430-6 - 2008/12/04 (木) 09:20:03 - ヒストン みさなまありがとうございます。 私が行いたい実験が �@細胞をコンフレントにする �Aその後、２％ＦＣＳの中にステロイドをいれるものと、いれないものをつくり14日間培養する �Bある遺伝子のpromoterのヒストンアセチル化の状態を観察する というものです。 �Aにおいて、ステロイドの有無でヒストンアセチル化に差がないという結果がでたのですが、assayのポシコンとして、必ずヒストンがアセチル化する刺激が必要になり、HDAC阻害剤をさらに投与したものも一緒に比較しようと思っております。 こういう場合、いつTSAを投与する場合か困っております。 すでに、コンフレントで１４日間培養していますが、その後TSAを数時間投与して、効果があるものなのでしょうか？また、TSA投与時は無血清のほうがいいのでしょうか？ ご教示いただけると幸甚です。

(無題) 削除/引用 No.2430-5 - 2008/12/03 (水) 19:29:56 - 名無し ここに出てるような実験で確かめてます。 http://direct.millipore.com/catalogue/item/17-305 昔のことで細かい条件とかはすぐにはでてきません。ただSodium butyrateとHistoneで検索していただければ、論文はたくさんあるとおもいますし、抗体の添付文書に特異性確認のデータで情報がのってるものもあるとおもいます。阻害剤でhistoneのアセチル化が全体として亢進してることは、最近はたくさん市販されているヒストン部位特異的アセチル化抗体でウェスタンブロットすればチェックできるとおもいます。ただ各阻害剤にもいちおうゆるいながら特異性がありますから、厳密には、調べようとしているその部位のアセチル化の増加と、全体としてのアセチル化の増加が必ずしも挙動を一にしないこともありうるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2430-4 - 2008/12/03 (水) 19:02:42 - 通りすがり ３日は長すぎです、基本的にHDACを阻害すると遺伝子発現レベル以外に 細胞分裂時のG2/M期の進行に影響するので 通常の細胞株の場合TSAなどの効果を見るなら ８〜１６時間程度の投与が目安です。 ３日かけて死ぬのはむしろ正しいです。大体２４時間から４８時間 ぐらいにかけてdapiなどで染めれば異常な分裂像が確認できるはずです。 コンフルエントには別にする必要はありません、 ８時間程度なら細胞は特に死にませんし。 あとTSAが利いたかどうかというのは、TSA処理後の細胞のlysateをwestern blottingし、H3K9Acなどの抗体で処理前と比較すれば一目瞭然でわかります、 数倍から数十倍にゲノム全体でのアセチル化量が増えるので。 あと蛍光顕微鏡があるならAcH3の免疫染色でもすぐわかります。 または細胞種にもよりますがp21やRARbeta2のようにHDAC阻害に感受性の高い(すぐ誘導される)遺伝子をRT-PCRなどで検出してもよいです、ただ癌細胞の種類などによってはダメなときもあります。

(無題) 削除/引用 No.2430-3 - 2008/12/03 (水) 18:52:56 - ヒストン ありがとうございます、特に特定のというわけではなく、ヒストンH3とH4をアセチル化したいだけでございます。 細胞がコンフレントになってから投与しても効きますか？「ヒストンがアセチル化した＝阻害剤が効いた」という証拠はどうやってたてておられますか？ ビュチレートつかった論文など、もし分かりましたら教えていただけませんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2430-2 - 2008/12/03 (水) 18:39:44 - 名無し ただ単にヒストンのアセチル化を人為的にがんがん増やしたいというだけなら、ビューチレート使う人が多いと思うけどだめですか。論文とか抗体の添付データとかに書いてあるくらいの濃度なら別に細胞死んだりとかはしないですけど。また細胞密度もそんなに気にしないでいいとおもいましたが。O/N処理ならば90%コンフレンシーくらいでやることが多いとおもいます。それとも特定のクラスのデアセチラーゼを阻害したいとかそういうことでしょうか。

ヒストンアセチル化に対するTSA 削除/引用 No.2430-1 - 2008/12/03 (水) 18:16:10 - ヒストン ChIP　assayである領域のヒストンアセチル化を検討しましたところ、非刺激群と刺激群で差がありませんでした。 これが差がないということをいうためには、実験のポジティブコントロールが必要となってきます。つまり、「かならずその部位がアセチル化する刺激」必要となってきます。 現在のところ、TSAなどを振りかけてみるしかないと思っております。 TSAは、「コンフレントになる前に３〜5日くらい投与する」とものの本には書いてありましたので、以前ちょっとやってみたのですが、3日くらいTSAを振りかけると、細胞が死んでしまいました。 皆さんは、TSAはどのように投与されていますか？ ・投与時のコンフレント程度（コンフレントじゃだめか？） ・投与時間 など、もしよろしければ教えていただけませんでしょうか？ また、「TSAが効いた」という確認はどのようになされていますか？

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