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(無題) 削除/引用 No.2427-5 - 2008/12/03 (水) 13:31:00 - AP すでに指摘がありますがDNAではないでしょうか。 ライセートの粘性が十分に下がっていますか？そのくらいのソニケーションでは十分にDNAが破砕されてないのではないかと思います。 粘性が下がるまで、ソニケーションを繰り返すか、DNaseを加えて4℃で緩やかに撹拌するといいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2427-4 - 2008/12/03 (水) 12:30:01 - あかね Filtrationしてみては？ 目視できるほどのフワフワ物なので、根詰まりするのは覚悟の上ですが、 filterを通り抜けたものはフワフワ物なしのfractionでしょう。 SDS-PAGEで解析するなら少量でいいでしょうし。

(無題) 削除/引用 No.2427-3 - 2008/12/03 (水) 05:08:11 - おお 高速(冷却)遠心機があるならそれをためしたほうがいいかもしれませんね 回転数はローターによりますが30000gくらいで30分とか、、 あとたんぱく質は上清にくるかどうかですが、それはどういう方法 どういうたんぱく質をとるかでなどで違うと思います。 インクルージョンボディーにくる場合は、上清のフラクションより 夾雑物が少なく、上清を捨てるというてを取ることもあります。 ですから上清のたんぱくをとるかとかの判断はそういうことを 考慮してから考えた方がいいと思います。上清にいこうする タンパクの量は、よりマイルドな条件にすることであるていど コントロールできると思います。たとえば、デタージェントを つかっていたら、その量を減らすとか、塩濃度をさげるとか、、 ソニケーションも細胞が破砕される程度でよわくしてみるとか、 フワフワして除けないものはもっと強い遠心でおとすか、すてるか ですね。うまく除けなかったらペレットをあらうというのも かんがえられます。

(無題) 削除/引用 No.2427-2 - 2008/12/03 (水) 01:03:59 - ぶりぶり ふわふわ？ DNAが残っているとか・・卵の白身みたいな雰囲気ですが 上清、ふわふわ、ペレットの３個に分けてみるのはいかがですか？ 少々の混入は仕方ないとしても、3層の大まかな混在タンパクは 解ると思います。少なくともターゲット蛋白の有無は判断できるでしょうし。

大腸菌のソニケーション 削除/引用 No.2427-1 - 2008/12/03 (水) 00:32:55 - たろう 現在封入体に入ると知られているタンパクの精製を行っています。 IPTGでタンパク発現を誘導させて遠心、上清を除去後、凍結融解２回、ソニケーションバッファー下でソニケーション（３０秒）を行い、遠心10000rpm, 15分を行っています。 　ここで問題なのですが、遠心後、上清とペレットの中間層にふわふわとしたどっちの層にもなりきれていない層ができてしまいます。 　目的のタンパクが封入体に入るはずなので、ペレットのみをグアニジンで溶かしたいのですが、このふわふわとした中間層が混ざってしまいます。 　また、念のため上清に目的のタンパクがいないかSDS-PAGEで確認するため上清のみを採取しようとしてもこの中間層が混入してしまいます。 　また、先日これらのサンプルでSDSーPAGE＋ウエスタンを行ったところ、目的のタンパクが上清の方に大量に認められてしまいました。 　中間層（実は不溶画分？）が混ざったためなのか、ソニケーションをかけすぎで一見可溶化し上清中に存在してしまったのか、など考えています。 　この遠心後のふわふわした中間層を経験された方はいらっしゃいますか？ もう一度遠心をかけてもやはりこの中間層が消えないのですが、これはどういう画分なのでしょうか？ 　また、封入体に入るはずのタンパクが、今回のように上清中に認められた原因はソニケーションによるものなのでしょうか？

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