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sequenceについて トピック削除
No.2426-TOPIC - 2008/12/02 (火) 20:00:09 - kobuhei
とても初歩的なところでつまずいています。

解決方法や、参考になりそうな資料や論文、文献、サイトなどを教えていただけたらと思います。

今、外生菌根菌からDNAを抽出して、sequencerで読み取り、ある樹種の菌根菌の種構成を知ろうとしています。

PCR後の泳導ではバンドが確認でき切り出すことができるのですが、sequencerにかけるとピークが重なり読み取ることができません。

今までの実験で、一つの属のみ読み取ることができました。

今までの状況についてなどはレスで答えたいと思います。

sequenceの成功のためのアイデアをいただけたらと思います。

よろしくお願いします。
　
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No.2426-7 - 2008/12/03 (水) 23:04:12 - ザンギ
連続投稿でちょっと恐縮です。
たぶん御存じだとは思うのですが、

MEDLINEは所詮医学系のデータベースですから、Google scholarで検索するといいですよ。

例えば
http://www.google.com/search?q=ectomycorrhizal+fungi+rDNA&btnG=Search&hl=en&sa=2

(無題) 削除/引用
No.2426-6 - 2008/12/03 (水) 22:42:00 - ザンギ
真菌類の多くは多核で、なおかつITS領域にも多型があったでのはと思いますが、いかがでしょう。
すると、そもそも、ダイレクトシーケンスで菌種を調べようとするところから無理があるのではないですか？

(無題) 削除/引用
No.2426-5 - 2008/12/02 (火) 23:58:44 - Pumpkin
たとえば、シングルアイソレートして分けてから、1コロニーづつPCRとかは出来ないのですか？技術的に困難かどうかはわかりませんけど（おそらく難培養だとか菌糸体で分離が面倒とか）。

プライマーセットをいくつ変えても、ユニバーサルだと同じ領域が増えてきてしまって、さらに増幅産物の見たいところは配列が異なるわけですから、シーケンスのピークの重なりは解消できないのではないですか？

うまいこと内部配列に制限酵素サイトがあると、いくつかは分けられるかもしれませんが、そうもうまくいきませんよね。候補がいくつか絞れるのであれば種特異的なプライマーで検出するとか、でも、どのくらいあるのかをみたいんですよね。クローニングして出てきたコロニーを全部読むのがいいのかな。96ウェル単位でシークエンスに出せば、すぐに読んでくれますよね。何枚か読めば、大体網羅できるのかな。この辺の計算はわかりませんが、PCRでバイアスがかかってると。。。

トピック立てた者です。 削除/引用
No.2426-4 - 2008/12/02 (火) 21:31:55 - kobuhei
レスありがとうございます。

NFさん
はい。ダイレクトシークエンスしています。
サブクローニングも考えていたのですが、とりあえずダイレクトでいけたらと考えていて。
プラスミドにクローニングすることも考えてみます。


Pumpkinさん
内生菌根菌については知識不足なのですが、外生菌根菌については一つの樹種に一つの種しか共生していないというのは、ほとんど見られないんです。
primerは、真菌類特異的なITS領域の１Fと４を使用しています。

短くして試そうと１fと２、３と４Bを今実験中で結果待ちです。
クローニングも考えて見ます。

(無題) 削除/引用
No.2426-3 - 2008/12/02 (火) 20:55:19 - Pumpkin
NFさんの言うとおりに、フラグメントをクローニングして読む必要があると思います。1つの樹種にいくつもの菌根菌が共生できるとは知りませんでした。

菌種を特定されるということで、たとえばITS領域とか、ある保存領域の塩基配列の違いをみているのですよね？だとすると、プライマーはユニバーサルなものをつかっているので増幅断片はほぼ同じサイズで、それをダイレクトシークエンスしてもだめだと思います。ただ、どれたけのクローンを読めば全部の共生菌をカバーできるかはわかりません。

昔、どこかで売っていたATとGCの含量で同じ大きさのフラグメントでも電気泳動度をずらせる試薬があれば、同じ大きさを持ついくつかのDNA配列を見ることができると思います。まぁ、もう売っていませんが。

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No.2426-2 - 2008/12/02 (火) 20:39:21 - NF
ゲノムＤＮＡ中の目的配列をＰＣＲで増幅して、それをダイレクトシーケンスしているということでしょうか？
ＰＣＲのバンドが単一に見えても何種類か混じっているのでは。
一度、プラスミドにクローニングしてみては。

sequenceについて 削除/引用
No.2426-1 - 2008/12/02 (火) 20:00:09 - kobuhei
とても初歩的なところでつまずいています。

解決方法や、参考になりそうな資料や論文、文献、サイトなどを教えていただけたらと思います。

今、外生菌根菌からDNAを抽出して、sequencerで読み取り、ある樹種の菌根菌の種構成を知ろうとしています。

PCR後の泳導ではバンドが確認でき切り出すことができるのですが、sequencerにかけるとピークが重なり読み取ることができません。

今までの実験で、一つの属のみ読み取ることができました。

今までの状況についてなどはレスで答えたいと思います。

sequenceの成功のためのアイデアをいただけたらと思います。

よろしくお願いします。
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