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(無題) 削除/引用 No.2420-8 - 2008/12/01 (月) 20:15:16 - たむら > えっと、バンドがぼやけるのと、複合体が見られるのは 別の話かもしれません。でほとんど移動しないバンド は肉眼、写真で見れているのでしょうか、、、 移動しないバンドを見た目で確認することはできていません。 siRNAのみをコームに入れた場合のみぼやけたバンドが見えるというのが現状です。 > siRNAとありますので2.5%では短すぎて分解能がない と思って良いと思います(多分20マーていどですよね)。 21bpのsiRNAを使用しているのですが、何%くらいのゲルを使うのがよいでしょうか？ ゲルに色素を入れて電気えいどうできると思いますがそっちの方がよいでしょうか？ 温度を下げることなどは試してみたいと思います。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2420-7 - 2008/12/01 (月) 20:02:28 - たむら > 文献を参考にしていらっしゃるとのことですが、複合体形成能には問題がなく、電気泳動に問題があるとお考えになる理由は、ぼやけているけれどバンドは見えているから、ということでしょうか？ バンドはぼやけていますが、見えているのでそう考えています。 > 差し支えなければ、参考にされた文献を載せてみては？ Delivery of siRNA mediated by histidine-containing reducible polycations. Stevenson M, Ramos-Perez V, Singh S, Soliman M, Preece JA, Briggs SS, Read ML, Seymour LW. J Control Release. 2008 Aug 25;130(1):46-56. Epub 2008 May 24. を参考に実験してみましたが、すべて同じ条件ではないのでそのせいなのかもしれませんが、条件を見比べまずいところがあれば指摘してください。 ＞アガロースでは複合体を形成している場合ではsiRNAが泳動せずにコームにとどまることが予想され、流れる流れないかで複合体形成が判断できると考えているのですが、PAGEだと複合体を形成していてもいなくてもsiRNAが流れると思われる ベクターとして合成したポリマーとsiRNAが複合体を形成した場合にはアガロースゲルでは網目をくぐることができず泳動しないと考えています。

(無題) 削除/引用 No.2420-6 - 2008/12/01 (月) 16:47:08 - おお > その実験系では > ゲルに入れて電気えいどうできるんでしょうか? > ゲルに色素をいれてということです。

(無題) 削除/引用 No.2420-5 - 2008/12/01 (月) 16:44:24 - おお えっと、バンドがぼやけるのと、複合体が見られるのは 別の話かもしれません。でほとんど移動しないバンド は肉眼、写真で見れているのでしょうか、、、 siRNAとありますので2.5%では短すぎて分解能がない と思って良いと思います(多分20マーていどですよね)。 濃度の選択は、示している実験に関しては経験が ありませんので、なんとも言いようがありませんが、 非常に小さいので拡散が早いかと思います。 染色時間を5-15分と短めにするのもてかと思います。 その実験系では ゲルに入れて電気えいどうできるんでしょうか? あとは、構造が長い2本さほど安定していない のが理由である程度ぼやけた感じになるかもしれません。 温度が上がらないようにうまく工夫するとか するとうまく行くかもしれません。ただし 最適温度は分かりません。低くても良いなら 氷の上でやるとか、コールドルームでやるとか、、 場合によってはプレＲＵＮしたほうがいいかもしれませんね。 RNaseはどこまでコンタミが防げてますか? それと、電気えいどうじかんは短くてもいいかもしれません。 ウェルのあたりにつまってしまったのと、siRNAをみるなら。 10分ぐらいでも分かれますよね。

(無題) 削除/引用 No.2420-4 - 2008/12/01 (月) 16:28:28 - mom-a 文献を参考にしていらっしゃるとのことですが、複合体形成能には問題がなく、電気泳動に問題があるとお考えになる理由は、ぼやけているけれどバンドは見えているから、ということでしょうか？ 差し支えなければ、参考にされた文献を載せてみては？ ＞アガロースでは複合体を形成している場合ではsiRNAが泳動せずにコームにとどまることが予想され、流れる流れないかで複合体形成が判断できると考えているのですが、PAGEだと複合体を形成していてもいなくてもsiRNAが流れると思われる ↑この理屈がよくわからないのですが、教えていただけないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2420-3 - 2008/12/01 (月) 15:46:30 - たむら ご解答ありがとうございます。 ベクターとsiRNAとの複合体形成能についてなんですが、条件や量的にはおそらく問題ないと思います。 そして電気泳動によって複合体形成を確認する場合、アガロースでは複合体を形成している場合ではsiRNAが泳動せずにコームにとどまることが予想され、流れる流れないかで複合体形成が判断できると考えているのですが、 PAGEだと複合体を形成していてもいなくてもsiRNAが流れると思われるのでアガロースで泳動して確認したいと考えています。 もっと低電圧でゆっくり流してみることは試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2420-2 - 2008/12/01 (月) 15:07:57 - ~ >ベクターとsiRNAとの複合体形成能 どのような条件で複合体形成が出来るのかが分からないのですが、 その部分の条件には問題が無いのですか？ 泳動についてだけだと、 >2.5% アガロースゲル PAGEだともっときれいに分かれませんか？ >100 Vで20分間泳動 もっと低電圧でゆっくり流してはいかがでしょうか。 >30分間浸して写真を撮影 脱染したら、バックグラウンドが減りませんか?

siRNAの電気泳動 削除/引用 No.2420-1 - 2008/12/01 (月) 11:58:08 - たむら こんにちは。 自分はsiRNAのベクターを合成しそれを評価しようとしているのですが、 ベクターとsiRNAとの複合体形成能を評価するために文献を参考にアガロースゲル電気泳動で評価しようとしているのですが、siRNAのバンド(ラダーのバンドも)がぼやけてしまっていい画が撮影できません。下に示すような条件で泳動を行っているのですが、何か改善点がありましたら教えてください。お願いします。 2.5% アガロースゲルでTBE buffer中で100 Vで20分間泳動 各レーンには、siRNA 50 ng/5 μLとベクター50〜500 ng/5 μLとLoading 　　　　　　　　buffer 2 μLを混合したものを入れています。 20分間泳動後にSYBR Green に30分間浸して写真を撮影しています。

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