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(無題) 削除/引用 No.2419-14 - 2008/12/02 (火) 14:10:00 - ats では、酵素反応条件は問題ないとして、 スピンカラム精製時に結合bufferのwashが不十分もしくはwash bufferの除去が不十分だったこともうちのラボメンバーが経験しています。ご注意を。

(無題) 削除/引用 No.2419-13 - 2008/12/02 (火) 12:20:02 - うぴてる 申し訳ない。単純に書き間違えてますね・・・。 制限酵素は反応液中に10〜15 U入ってます。 制限酵素は最後に入れていますね。 基本はmiliQを希釈に必要な量を入れたものにbufferを加えて、vectorを加えて最後に制限酵素という形を取っています。

(無題) 削除/引用 No.2419-12 - 2008/12/01 (月) 19:43:50 - りょう APさんとPumpkin さんが仰るように酵素量少ないですね。10単位入れて１時間でいけるんじゃない？

(無題) 削除/引用 No.2419-11 - 2008/12/01 (月) 18:14:16 - Pumpkin 酵素量と反応時間（特に1時間とか）が短すぎるに一票。

(無題) 削除/引用 No.2419-10 - 2008/12/01 (月) 18:01:59 - AP 後で気がついたのですが、 >制限酵素 ：1 μl（1 U量） ふつう制限酵素は1 uLあたり10単位前後になっていると思いますが、これはわざわざ希釈して入れたと言うことでしょうか。プラスミドを消化するときは、酵素によりますが、リニアを消化するときの数倍から数十倍の単位数が必要です。自前で精製したDNAなら活性を妨げる夾雑物があることもあってさらに多くの酵素を必要とする場合もあります。この場合は、10〜20単位くらい使ってもいいと思います。わざわざ希釈すると無駄がでますし、希釈・吸着による失活の危険があります。

(無題) 削除/引用 No.2419-9 - 2008/12/01 (月) 16:12:14 - ats 念のため確認ですが、制限酵素はMiliQで希釈してから最後に加えていますよね。 この順番だと10xbufferで失活しそうです（100%失活はしないと思うけど）。 > 反応系は > 制限酵素 ：1 μl（1 U量） > 10 * buffer :2 μl > ベクター : 0.5 μl(0.5 μg) > 20μlにMiliQでサイズアップ

(無題) 削除/引用 No.2419-8 - 2008/12/01 (月) 13:10:53 - うぴてる 皆様ありがとうございます。 自分としてもベクターの方に何らかの問題があると考えていたのですが、どうやらその見解の流れで良さそうですね。ベクターを再抽出して見たいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2419-7 - 2008/12/01 (月) 12:40:57 - AP プラスミドはカラム精製ということですが、Alkali lysisのステップが入っている方法ですよね。 アルカリ処理でプラスミドが不可逆的に部分変性して制限酵素で切れなくなることが知られています。Alkali lysisをすると多かれ少なかれそういうプラスミド分子が混じるのは避けられないのですが、処理が過剰（時間が長すぎ、温度が高すぎ、アルカリ濃度が高すぎなど）だとかなりのフラクション、場合によってはすべてのプラスミド分子がそういう状態になる可能性があります。 その点に注意して、プラスミドを精製し直してみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2419-6 - 2008/12/01 (月) 12:20:36 - りょう 本当は切れているけど、泳動パターンの読み間違い（cccと直鎖の違いが判断できていない）の可能性が否定できません。 １，２kbのインサートが切り出される組み合わせで切ってみてはいかがでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2419-5 - 2008/12/01 (月) 12:15:52 - ~ １．他の適当な制限酵素では、お使いのベクターは切断されますか？ ２．取り直したベクターも、切れませんか？ ３．他の適当なベクターは、お使いの酵素で切断されますか？ まず疑うのは、ベクターがおかしい（汚いor制限酵素サイトが無いor違うベクターだった）あたりで、 次に疑うのは制限酵素がおかしいことだと思います。 制限酵素3種類で、どれでも切れないのであれば、 ベクターを取り直すのが近道のような気がします。

(無題) 削除/引用 No.2419-4 - 2008/12/01 (月) 12:07:52 - うぴてる 早い反応ありがとうございます。 ＞直鎖状になったかなっていないかは何を根拠に判断なさっていますか？プラスミドのサイズによっては、cccと直鎖状の泳動度が近いこともあると思いますが。 電気泳動での確認を行っています。ただ、cccと直鎖状の泳動度が違うものと考えて測定しています。というのは、利用しているベクター（pYES2）は6.9 kbpで、環状のまま流すと約5 kbpにバンドが現れるので、切断されれば7 kbpにバンドが現れると考えたからです。 ＞他のベクターは切断できますか？ ＞酵素量を増やしてみては如何でしょうか？ 残念ながら、他のベクターを研究室で保有していない（自分が初めて遺伝子触りだしたもので）ので試せていません・・・。ベクターによって切れやすいものがあったりするのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2419-3 - 2008/12/01 (月) 11:59:50 - taka 他のベクターは切断できますか？ 酵素量を増やしてみては如何でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2419-2 - 2008/12/01 (月) 11:38:13 - 万年 直鎖状になったかなっていないかは何を根拠に判断なさっていますか？プラスミドのサイズによっては、cccと直鎖状の泳動度が近いこともあると思いますが。 ３種の酵素で全く切れないというのはちょっと考えにくいです。

ベクターが制限酵素で切断できない 削除/引用 No.2419-1 - 2008/12/01 (月) 11:29:07 - うぴてる 初めまして。 pYES2という、酵母用のベクターを利用しているのですが、マルチクローニングサイトでの制限酵素切断を巧く行う事ができません。 使用した制限酵素は、 BamHI：ロッシェ　タカラバイオ SacI：ロッシェ　NBE KpnI：ロッシェ　フェルメンタス それぞれ同封されたbufferを利用しています。最終的にはdouble digestion する予定ですが、単一酵素のみを利用しても切断できないので困り果てています。 反応系は 制限酵素 ：1 μl（1 U量） 10 * buffer :2 μl ベクター : 0.5 μl(0.5 μg) 20μlにMiliQでサイズアップ 1〜3時間、酵素の活性がある温度（30、もしくは37℃）で処理。 ベクターについてはスピンカラムを利用してMiliQで溶出、生成しています 。 この条件で、反応後すぐに電気泳動をかけてみているのですが。鎖上のベクターが見られません。アルカリフォスファターゼ処理を行っても同様でした。

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