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再度検討します 削除/引用 No.2418-11 - 2008/12/09 (火) 07:27:28 - Western 皆さんご回答ありがとうございました。 皆さんの意見を参考にして、何回か行なったところ、少しは非特異的バンドが減少しました。 今後、別の会社の抗体の購入を含めて、サンプル調整なども検討していく予定です。

(無題) 削除/引用 No.2418-10 - 2008/12/03 (水) 16:42:12 - C はい。非特異的なシグナルは出でこまったことはそんなに多くはないので、どっちかというとまえに書いた競合実験は見えてるももが本当に抗原蛋白質かということを確認するためにやってました。非特異的なものが消えることはなかったようにおもいます。もし似ている蛋白質と反応してるなら、それは非特異的反応とは少し意味が違うかもしれません（交差反応とかいうのでしょうか）。自分の望む抗体自体はちゃんと働いていて、一緒に出来た望まない抗体が何か変なことしてるわけではないのですから。あと抗体の種類によらず非特異的バンドはよく５０ー６０ＫＤくらいを中心にスメア引きながら数本出てくるのをよく見るのですがどうでしょうか。最近あれケラチンではないかとおもうのですが。免疫するときや、抗原エマルジョン調製や（あるいは抗原の精製の過程）で術者の手などから毎回混入して、免疫されてしまい抗ケラチン抗体も作っているのではと。というのがSPFで免疫してたとき（手袋帽子専用白衣マスク着用の状態）は、なんかたいてい良質の抗体が取れていたような気がするのです。もちろんこうした問題があっても抗原カラムで抗体を精製すれば解決するとおもいますが。

(無題) 削除/引用 No.2418-9 - 2008/12/02 (火) 21:46:02 - おお >[Re:5] Ｃさんは書きました : > WBでの抗体の特異性の確認についてはノックダウンで調べる必要があるとの指摘もっともと思います。しかし私は、動物組織を材料としてWBしており、KO動物をすぐに用意できません。そういうときはどうしたらいいでしょうか。（いままでは、分子量が合っていてシングルバンドで抗原蛋白質で競合してシグナル消えればOK、というレベルで特異性をかなりいいかげんに判断してました。） 逆にお伺いします。これって非特異なバンドも消えたりしませんか? たとえば、よくキャラクタライズされているものであれば、培養レベルで刺激して変動がある系をつかい、予測される変動があるものは、考えている抗原を認識しているでしょうし、その比較で組織の見たいバンドを見分けることができることもあると思います。あとは組織間、細胞間の発現の違いから見いだせることもあるかと思いますし、細胞にcDNAを発現させて増えるバンドを指標にするてもあるかと思います。 ただし、アイソフォームや修飾の違いでサイズが変わることもあるので、そこを見分けられるかが難しいところですが、、

(無題) 削除/引用 No.2418-8 - 2008/12/02 (火) 15:05:21 - 万年 Can Get Signalで改善した経験が私もあります。ただ、効き目は抗体に依りけりですよね。 ところで、あれ、成分は何なんでしょう？どなたかご存じありませんか？また、同様の目的で使うことのできる市販品って他にご存じありませんか？

(無題) 削除/引用 No.2418-7 - 2008/12/02 (火) 13:40:35 - MP 決してTOYOBOの回し者ではないのですが、Can Get Signalを使うと特異性が劇的に改善することも時々あります。

(無題) 削除/引用 No.2418-6 - 2008/12/02 (火) 13:26:13 - 小児科医師（ゆとり教育） 私はリン酸化Smadを見ているのですが、同じように非特異的バンドで苦労しました。 １．1次抗体（Cell Signaling Technology社：以下、CST）、室温1時間 　　2次抗体（Sigma社）、室温1時間 ２．1次抗体（CST)、4℃/overnight 　　2次抗体（Sigma社）、室温1時間 ３．1次抗体（CST）、4℃/overnight 　　2次抗体（CST)、室温1時間 上記のように3通りの方法を試したのですが、 １．非特異的バンドが多数出て分子量マーカーを一緒に流しても全く見当がつきませんでした。 ２．バンドが全く検出されませんでした。 ３．きれいにバンドが出ました。 ポイントとしては、1次抗体は低温で長時間反応させた方が特異性が上がることが多いようです。私の先輩は、4℃/overweekendで実験している先生もいます。1次抗体と2次抗体の相性もあるようで、私の場合、２．と３．は2次抗体の会社が違うだけですが、全く反応が異なりました。 また、ポジティブコントロールがあるとかなりいろいろなことが分かるのでまずはポジティブコントロールを手に入れるといいと思います。販売していればいいのですが、販売していない場合には自分で作成するのはなかなか難しいので、1次抗体を購入した会社に問い合わせるといいと思います。私はCST社に問い合わせたところ、phospho smad2のポジティブコントロールを分けていただきました。 以上、参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.2418-5 - 2008/12/02 (火) 13:22:47 - Ｃ WBでの抗体の特異性の確認についてはノックダウンで調べる必要があるとの指摘もっともと思います。しかし私は、動物組織を材料としてWBしており、KO動物をすぐに用意できません。そういうときはどうしたらいいでしょうか。（いままでは、分子量が合っていてシングルバンドで抗原蛋白質で競合してシグナル消えればOK、というレベルで特異性をかなりいいかげんに判断してました。）

(無題) 削除/引用 No.2418-4 - 2008/12/01 (月) 17:21:05 - おお >[Re:1] Westernさんは書きました : > 皆様は、このような場合は、どのような方法で非特異的なバンドを無くしていますか? > 抗体を替えた方がいいのでしょうか? > サンプルは無血清培地で培養したサンプルを使用し、ブロッキングは5% skim milkにて室温1時間で行なっています。 > ほかにいい抗体があるようなら変えるのも選択し かとおもいますが、、 ネガコン(KDとか発現してない細胞とか)をとって 特異性が確認できるのなら、許容範囲である場合 もありますね。 サンプルは培養上清でしょうか?バイチにはクロス リアクトしそうな成分は入っていませんでしょうか 脳下垂体抽出物とか、、、、 ノンスペは原因がいろいろあると思いますが、 2次抗体が何か直接認識しているわけでは ないですよね。もしそうだとすると1次抗体の 条件を動かしても意味ないですから。 1次抗体の非特異なバンドをへらすのは、効果的では ないかもしれませんが幾らか方法はあると思います。 まず濃度は検討しましたでしょうか。 抗体を反応させるバッファーの塩濃度、デタージェント などをいじるのも考えられるてです。 もし非特異なバンドと断定できるなら、そのソース 例えば発現してない培養上清を抗体反応溶液 に混ぜて吸収した状態で反応させるのも ありです。 でも条件検討にどこまで力注げますでしょうか、、 自分で作った抗体ならまだしもという感じも ありますし、 それと、その抗体を使っている文献はないですか、 抗体反応溶液を工夫してやっていてその組成とか 書いているかもしれません。 実際私はあまりそういうのはいじらないですけど。

(無題) 削除/引用 No.2418-3 - 2008/12/01 (月) 13:04:52 - - 市販抗体でダメなものはいくらでもあります。 非得意的なバンドが多い場合は大抵ダメな場合が多いし、サイズが合っているからといって目的の蛋白を認識しているとは決していえません。 最終的にはノックダウンで目的のバンドが消えるかどうかなど確認する必要があるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2418-2 - 2008/12/01 (月) 11:19:36 - 名無し おそらく抗体の質的な問題と思いますので、メーカーに直接、あるいは代理店を通してわけを話して返品し、別のロットと交換してもらうのが早道とおもいます。データも添付してくださいと言われるかもしれないので、non-specificなバンドがたくさんあるものも捨てないで保存しておいた方がいいです。

WBでの非特異的バンド 削除/引用 No.2418-1 - 2008/12/01 (月) 10:18:50 - Western 現在Western blottingでのタンパク発現を検討しています。 今回、抗体を購入し、使用しましたが、かなりの数の非特異的バンドが検出されてしまいます。 目的のサイズのバンドは確認できるので、そこだけに注目すればいいのかもしれませんが、ここまで非特異的バンドが多いと、目的のサイズのバンドも特異的なものなのかどうか疑わしいと思っています。 皆様は、このような場合は、どのような方法で非特異的なバンドを無くしていますか? 抗体を替えた方がいいのでしょうか? サンプルは無血清培地で培養したサンプルを使用し、ブロッキングは5% skim milkにて室温1時間で行なっています。 アドバイス、お願いします

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