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単純に 削除/引用 No.24-17 - 2007/08/10 (金) 18:59:19 - 酵母万 長すぎるのが問題だと思いますよ。 その長さだと、プロモーターとかですか？ 長すぎると入りにくいし、ＰＣＲの際に配列間違える可能性も高いので、 私は、いくつかに分割してクローニングしました。 （途中にユニークな制限酵素があったので） もし分割させることができれば、短いのでクローニングできる効率が上がります。 また、配列ミスの可能性も低下するので便利です。 分割した部分ごとにシークエンスをし、配列が正しいものを選択します。 で、最後に、乗せ替えをして、全長を作ります。 ↑最後はＰＣＲをしてないので、全長さえできてしまえばシークエンスをする必要がありません。

(無題) 削除/引用 No.24-16 - 2007/08/09 (木) 17:48:36 - う〜んと TOPOはインサート長に好き嫌いがあるような気がします。 たまたまTakaraの販促パンフを眺めていたら、長鎖DNA用のライゲーションキットが出ているようですね。

切れのこり 削除/引用 No.24-15 - 2007/08/08 (水) 13:14:32 - kawa ＞そもそもTAクローニングでブルー／ホワイトセレクションを使うことはあまり意味がないのではないでしょうか？ メーカー品でも切れのこり（片切れ、両切れのこり）は結構残留してますので、青白は絶対効果的だと思います。 ＞promegaのpGEM-T vectorとInvitrogenのTOPO cloning systemを使ったことがありますが、 TOPOの方が圧倒的に良い印象です。白コロニーを拾えばインサートが入ってる確立が非常に高く、擬陽性がかなり少なかったように思います。ただ、TOPO systemで16.5kbという長さのものをクローニングした経験はありません。 同感です。ただTOPOはもともとコロニーが少し出にくい気がしますが・・・。

TOPO 削除/引用 No.24-14 - 2007/08/04 (土) 05:32:00 - IKA promegaのpGEM-T vectorとInvitrogenのTOPO cloning systemを使ったことがありますが、 TOPOの方が圧倒的に良い印象です。白コロニーを拾えばインサートが入ってる確立が非常に高く、擬陽性がかなり少なかったように思います。ただ、TOPO systemで16.5kbという長さのものをクローニングした経験はありません。

どうでもいいことですが 削除/引用 No.24-13 - 2007/08/04 (土) 04:34:02 - 通りすがり DH5aはIPTG要らないのでは？

そういえば 削除/引用 No.24-12 - 2007/08/03 (金) 17:45:18 - りり A-Addition キットというQIAGENのキットを処理すると入るようになったという人がうちの研究室にいました。ゲル抜きして50度の熱をかけて精製したフラグメントは、末端Aがやや削れているような感触があったそうです。 全て削れているとはいえないと思いますが…

(無題) 削除/引用 No.24-11 - 2007/08/03 (金) 16:52:53 - ＴＡ いや、ヌクレアーゼ活性の混在などで末端が削れてベクターだけが環状化することがあるのは分かるのですが、その際にフレームが合ってlacZ positiveになることが、ならないことよりも有意に起こりやすいと考える理由はないのでは？というつもりでした。

(無題) 削除/引用 No.24-10 - 2007/08/03 (金) 16:14:31 - 通りすがり >そもそもTAクローニングでブルー／ホワイトセレクションを使うことはあまり意 >味がないのではないでしょうか？ 理論的にはそう感じてしまいますが、実際にはリガーゼなどにヌクレアーゼ活性などが多少混在していることがあるので、T末端などが欠失して 結果的にセルフライゲーションなどがおきてしまうことがあるのですよ。 まあそんなに面倒でもないのでカラーセレクションしたほうが 良いでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.24-9 - 2007/08/03 (金) 13:45:02 - TA そもそもTAクローニングでブルー／ホワイトセレクションを使うことはあまり意味がないのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.24-8 - 2007/08/03 (金) 12:08:38 - Ｔ ところでPCR産物はどのように精製されているのですか？ ゲル抜きしておられるなら結構ですが、もしエタ沈等の簡易精製だけならプライマーダイマーのような小さな産物が混入していて、そちらが優先的に組み込まれている可能性があります。空ベクターと思っているものを幾つかシークエンスしてみましたか？ 本当に何のインサートも入っていない空ベクターばかり生えてくるなら、ベクターの調整法を疑うべきでしょう。メーカーから調整済みのベクターを買っているなら、保存している間に何かがコンタミして末端が削れてしまったのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.24-7 - 2007/08/03 (金) 10:54:34 - tm LAtaqなら大丈夫なはずですね。Eこりさんのおっしゃっているとおりインサートが大きいからだと思います。pGEM-T easyには3kb位までしか入れたことがないので、何とも言えませんが

(無題) 削除/引用 No.24-6 - 2007/08/02 (木) 23:32:40 - 10138 TOPO VECTORの取説には3〜10Kbpのクローニングに優れていると書いてありました。 私は約9Kbpを良好にクローニングしました。 参考までに。 114http://www.invitrogen.co.jp/products/pdf/2003-52-MB.pdf#search='TOPO vector'

両端にレアカッター配列をつけて 削除/引用 No.24-5 - 2007/08/02 (木) 23:17:51 - 一産婦人科医 切って入れた方が早いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.24-4 - 2007/08/02 (木) 18:32:53 - TN ご返信ありがとうございます。 > tm様 Taqは、TaKaRa LA Taqを使用しています。 断片の3'末端にAが付加されているはずだと思うのですが…。 > Eこり様 空ベクターについてはまだやっていません。 今やっているところなので、明日の朝には結果が出ると思います。 インサートの長さですが、過去に最大26.5kbの断片のライゲーションに成功した例があるので（私がやったわけではありませんが）、なんとかなるかと思っているのですが、やはり難しいのでしょうか？ TOPOベクターを使うと長鎖の断片も簡単に入るようなので、そちらを使う選択肢もあるかとは思っているのですが…。

(無題) 削除/引用 No.24-3 - 2007/08/02 (木) 17:04:30 - Eこり 空ベクターを入れた大腸菌を培養して青くなりましたか？ また、培養終了後４℃に保存し、しばらく（半日くらい）すると鮮明に青くなります。 的外れかもしれませんが、ちょっと気になったのは、インサートさせるサイズが大きいかなと思いました。私も３年前までpGEM-T vectorを使っていたのですが、あまり大きなサイズのものは入らなかった覚えがあります。たしか3〜4Kbpくらいまで。（私が技術不足だったらごめんなさい。） 私の場合は、pGEM-T vectorに簡単に入るサイズにPCRを分けるか、 Vectorを大きなものを入れるのに優れたVectorにしてみました。

初歩的なことですが 削除/引用 No.24-2 - 2007/08/02 (木) 15:10:41 - tm 大丈夫だとは思いますが、PCR産物の末端はTAクローニングできるようになっていますか？Taqは何を使っていますか？

ブルーホワイトセレクション 削除/引用 No.24-1 - 2007/08/02 (木) 13:20:40 - TN 現在PCR産物をライゲーションしてベクターに組み込み、大腸菌形質転換によりサブクローニングをしようとしています。 PCR産物はおよそ16.5kb、使用しているベクターはpGEM-T easy vector、大腸菌はTaKaRa E. coli DH5a Electro-Cellsです。 LBプレートに撒くと数百個のコロニーが出てくるのですが、当初ブルーホワイトセレクションを行っていませんでした。 100個近くコロニーをつついてプラスミドを精製し、制限酵素で切断して泳動でバンドパターンをチェックしたのですが、すべてベクターのバンドのみで、PCR産物が挿入されていませんでした。 そこで、ブルーホワイトセレクションを行うことにしたのですが、すべて白いコロニーになってしまい、青コロニーが1つも出てきません。 X-GalやIPTGの濃度等はpGEMのプロトコル通りにしていますし、プレート作製後すぐに使用しているのですが…。 どなたが解決方法をご存知の方はいらっしゃいませんでしょうか？ なお、プレートの組成ですが、LB / Ampの培地にそれぞれIPTGを0.5mM、X-Galを80ug/mlの濃度になるように加えています。 よろしくお願い致します。

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