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念のため 削除/引用 No.2392-24 - 2008/12/03 (水) 17:23:14 - POM H5さん　ありがとうございます。そういう設定があったのですね。参考にしてみます。 お隣の研究室が科研費で購入したものの、現在使っているのは私の研究室のうち二人だけです。それなので、現状ではその二人しか関与しておらず、一応その人とも相談して共通の認識です。せっかくのいい機械がもったいないです…。 一応、このレスは問題解決としたいとおもいます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2392-23 - 2008/11/30 (日) 11:57:37 - ss ちょっと気になったのですがPOMさんの解釈について研究室の他の人に話したのですか？ 一人で使っているのならはなしは別ですが、その人たちはFITCのイメージはちゃんと撮影できているのでしょうか？

一応念のため 削除/引用 No.2392-22 - 2008/11/29 (土) 23:12:36 - H5 私の言ったFlowview上の設定というのは、 「検出する色素に応じてどういう設定にしたらいいか、ガイドを表示できる」 つまり、どのチャンネルのどのフィルターを入れるのか、それとも抜くのか、 といったことを絵で図示してあるものです。 Tさんがリンクを貼ってくれていた、 http://www.cris.hokudai.ac.jp/openfacility/catalog/01_305_fv300.pdf の4ページ目の右下部のような画面だったと思います…確か。 私が撮影していた時は特に問題がなかったもので、 入っていたフィルター等をちゃんと覚えていないので、 曖昧で申し訳ないのですが… 「ソフトが勝手に最適な条件を選んでくれるように指定する」は、 もしかしたらシーケンシャルモードで撮影するのに必要な、 dyeを選ぶ設定のことを言っているのかと思ったので 一応念のために書いておきます。 的外れだったらごめんなさい☆ あと、撮った写真が正しいかどうか、は、 Single Stainの結果や蛍光顕微鏡で自分の目で観察した結果と 撮影した写真がかけはなれていないかを私は重視してます。 やっぱり人間の目は優秀だと思いますよ。 もっとも、蛍光顕微鏡がwide rangeのフィルターだと、 青励起でCy3がかぶって見えてくるとは思いますが… 私はやはり経験上Cy3はあまり好きではないです。

(無題) 削除/引用 No.2392-21 - 2008/11/29 (土) 15:39:39 - ＰＯＭ ご指摘有難うございます。シーケンシャルはおっしゃるとおり、それぞれ単独で励起させて蛍光を別々に検出する機能です。一応、確認したところ、ＦＩＴＣとＣｙ３どちらともかぶりはなかったです。ＦＩＴＣがＣｙ３側へ入るほうが多いとはおもいますが、その逆も結構多いみたいですね。Ｈ５さんのいうように、ＦＶ３００では検出したい蛍光色素を選択して、ソフトが勝手に最適な条件を選んでくれるように指定する欄があり、僕もそれを使っています。最近はＧＦＰとＣＹ３ですが、こちらはソフトの設定だと多少無理があるので、自分で設定を調節していますが。

(無題) 削除/引用 No.2392-20 - 2008/11/29 (土) 00:06:08 - えー > あと、えーさんのご指摘なのですが、3重染色の場合は基本的にシーケンシャルで撮影を行っており、各蛍光色素ごとに励起光、SDM、吸収フィルタをその都度最適なものを選択して得られた画像をMergeしております。 オリンパスは使ったことが無いので想像ですが、シーケンシャルっていうのは、それぞれ独立して励起波長を当てることですか？一回の励起でGもRも同時に励起する場合よりクロストークの可能性は低下しますが、サンプルによっては（色素によっては）G(B)単独染色であるにも関わらず長波長のR(G)励起を当てているのに蛍光が観察される場合もあるそうです。顕微鏡メーカー技術者の人から聞いた話です。 > Cy3は488でMaxの20％ほどのEmを示すので、SDM570だと、Cy3の傾向がCH1に紛れ込んでくる理屈は理解できます。 上記内容に注意する人は多いが、長波長側の励起光で短波長側の蛍光試薬が悪さをするリスクを注意する人はまだまだ少ないので・・と技術者は嘆いていました。 ただ、バンドパスフィルタ（BA）が505-525で、Cy3のEmは520〜ですが、立ち上がってくるのは530以降で、520-525の間でのEmレベルはほとんど０であると思いますので、実際に拾ってくるCy3はCy3がいくら明るいといえども、無視できると考えています。BAが550前後まで拾うことになると、問題になることも聞いたことがありますが、どうでしょうか。 　「思いますので」ではPOMさん自身が不安になりませんか？是非とも確認試験を行って下さい。H5さんのコメントもあることですし、ご自身で確認された方が安心でしょう。 >たしかにCy3はあまり多重染色には向かないかもしれませんね。あと、SDM505を通すと、FITCは暗くても少しぐらい見えるだろうと考えられるのですが、僕の撮影条件だと、実際はまったく見えなくなります。 　Cy3が向かないというより、FITC（弱い蛍光）とCy3（強い蛍光）の組み合わせが不向きなのだと思います。思い切ってローダミンとかテキサスレッド を採用する or 逆にFITCをやめて、強い蛍光色素を採用するとか　は無理でしょうか？ 　最近のソフトウェアは優秀なので、パソコンが勝手にレーザー強度やディテクターゲインを調整してくれるのですが、FITCは強いレーザーで荒い画像とのコメントがあったように、無理やり検出しようと余計なお世話をしてくれることも多々あります。ご自身でレーザー強度などのパラメーターを変更する手間も、この経験を機会に勉強してみるのもいかがですか？ 　顕微鏡の特性に併せて染色条件（色素の選択から撮影条件まで）を自由にコントロールする。これこそ研究者の腕の見せ所だと私は考えております。他グループの写真を常に疑ってしまう、私の悪いところですがご容赦を願います。

FV300 削除/引用 No.2392-19 - 2008/11/28 (金) 16:37:17 - H5 ちょっと話がずれていたらすみません。 私も以前FV300を使っていましたが、 Flouviewのソフト上に、検出する色素に応じてどういう設定にしたらいいか、 ガイドを表示できる画面があったと思いますよ。 （それじゃ解決になりませんか？？） 今手元にないので具体的にどのボタンとか言えないのが 申し訳ないのですが… FITCとCy3で二重染色もしたことがありますが、 いつもシーケンシャルモードで撮っていました。 普通に撮るとやっぱりかぶってきますよ。

ありがとうございました。 削除/引用 No.2392-18 - 2008/11/28 (金) 04:36:46 - POM 皆様、あまり理解せずに質問していたのに、丁寧に応えていただきありがとうございます。決して不快な思いはしていませんよ。とても勉強になりました。けいさんのおっしゃる通り、確かに505でCH2にFITC用の吸収フィルタを移したいというのは正直なところなのですが、装置は実は借り物ですので、勝手にいじれないのです・・・。一応、自分の解釈で間違いではないということですので、このまま撮影したいと思います。 あと、えーさんのご指摘なのですが、3重染色の場合は基本的にシーケンシャルで撮影を行っており、各蛍光色素ごとに励起光、SDM、吸収フィルタをその都度最適なものを選択して得られた画像をMergeしております。 Cy3は488でMaxの20％ほどのEmを示すので、SDM570だと、Cy3の傾向がCH1に紛れ込んでくる理屈は理解できます。ただ、バンドパスフィルタ（BA）が505-525で、Cy3のEmは520〜ですが、立ち上がってくるのは530以降で、520-525の間でのEmレベルはほとんど０であると思いますので、実際に拾ってくるCy3はCy3がいくら明るいといえども、無視できると考えています。BAが550前後まで拾うことになると、問題になることも聞いたことがありますが、どうでしょうか。たしかにCy3はあまり多重染色には向かないかもしれませんね。あと、SDM505を通すと、FITCは暗くても少しぐらい見えるだろうと考えられるのですが、僕の撮影条件だと、実際はまったく見えなくなります。

(無題) 削除/引用 No.2392-17 - 2008/11/28 (金) 01:12:18 - けい POMさんの書かれた条件であれば，その解釈でかまわないと思います． これまでのコメントは無視してください． 不快な思いをさせてすみませんでした． 負け惜しみですが，そのセッティングでFITCを撮影したくありません． 私なら，FITC（BA505-535）のフィルターはCh2に移してSDM505と組み合わせて観察するでしょう． それでは，POMさんがんばってください．

POMさんはあっていると思うが 削除/引用 No.2392-16 - 2008/11/28 (金) 00:31:59 - えー 基本的にあっているような気がします。オリンパス使用経験なしですが。 ただし、気になることもあります。 いままでにCy dyeを使ったことはありませんので推測ですが、 それは蛍光の漏れです。 ＞Cy3552nm　　　580nm Cy3のEm maxは570nm以上なのでSDM570でCH2で検出することになるのですが、 あくまでMaxであって励起スペクトルには幅があります。 　Cy３単独染色でSDM570に設定してもCH1にはCy3由来の蛍光がリークしてくるはずです。 特にFITCとCy3では明るさが違うので（蛍光の明るさ？効率？モル吸光係数？正しい言い方を理解していませんが）、測定時のレーザー強度やゲインを上手く設定しないとCy3単独染色なのにSDM570＆BA505−525のCH1でもCy3が検出できる可能性が懸念されます。 　この可能性を否定するために、SDM505に固定して、Cy3が絶対にCh1で検出されない条件＆FITCの蛍光スペクトル上505でも観察できる（蛍光は弱くなるけどしかたないでしょ、Cy3が漏れてくるんだもーん）ということをオリンパスが主張しているのではっと予想しています。 　以上が私の考えです。乱文失礼いたします。 追 　：FITC単独染色して観察条件を設定する。同時にCy3の設定で画像取得して何も観察できない事を確認する。（CH2でFITCは観察できない事を抑える） 　逆に、Cy3単独で染色してCy3の観察条件を設定する。同時にFITCの観察条件で何も観察できないことを確認する。（CH1でCy3が検出されない事を抑える。ここが私の主張のキーポイント） 　最後にCy3、FITCの二重染色を観察し、上記で設定した観察条件で画像取得する！ 　結果として得られる画像はCy3とFITCの局在を反映している！（次にクロストークの可能性も排除するべきですが）そこで初めてmergeして共局在とかの議論が可能になる！ここまで考慮してほしいなー

すいません 削除/引用 No.2392-15 - 2008/11/27 (木) 23:17:51 - POM Tさん、ご指摘ありがとうございます。僕の勘違いもあり、話がかみ合ってなかったようです。けいさん、すいませんです。 もう一度、訂正および、話の筋を戻したいと思います。 まず、使用しているものはFV300です。 勘違いしていたのはダイクロイックミラー（DM）に関してですが、これはDM405/488/543でした。なので、これをいじることはありません。 僕がDMと思っていたのは、検出器の入り口にある検出ﾓｰﾄﾞ設定スライダ（SDM）です。これはあくまで励起されてDMを透過してきた蛍光をCH1とCH2へ分類するもので、Mirror（すべてCH1）、SDM505（505より短いものはCH1へ、他は透過しCH2へ）、SDM570（570より短いものはCH1へ、他はCH2へ）のいずれかを選択し、CH1とCH2に分類するようになっていまして、当研究室の九州フィルタは CH1：BA430-460とBA505-525、CH2：BA565IF、BA610 の組み合わせになっています。 なので、DAPIとFITCはCH1で、Cy3やPIなどはCH2で検出するとなるのですが、購入以来、「SDMは505で固定する」とシールが貼ってあり、この前来たOLYMPUSの営業の方もそう言ってました。しかし、SDM505では、FITCの蛍光がCH1で拾うことができないでしょ？と、僕は言いたいわけです。で、僕はFITCを観察する時に、SDMをMirrorか570に設定して画像を取得しているわけなのですが、OLYMPUSの人もそう言うし、周りに詳しい人もいないので、自分のとっている画像にいまいち自信がなく、質問したという次第です。 なので、Kさんがおっしゃったように DAPIとCy3の二重：SDM505、CH1：BA430-460とCH2：BA565IFでよいのですが、FITCとCy3の二重：SDM570、CH1：BA505-535とCH2：BA565IFといったように、SDMも切り替えないと駄目なはずと考えるわけです。 長くなってしまいましたが、これでどうでしょうか… 聞きたいことは、つまり「あなたの考え方であっているので、画像は正しいです」あるいは、「いや、その考え方はここが間違っているので、取得した画像は偽物だ」のどちらでしょうということになります。 よろしくおねがいします。

(無題) 削除/引用 No.2392-14 - 2008/11/27 (木) 20:52:02 - けい Tさん，ありがとうございます． No.2392-9とNo.2392-12の書き込みはFV300についてです． FV500の内容は全く見ていませんでした． だから，No.2392-9ではFV300（FV3000と書いていますが）の測定原理の確認を No.2392-12の最後ではセッティングを確認をとコメントしたわけです．

(無題) 削除/引用 No.2392-13 - 2008/11/27 (木) 20:08:09 - T どうも話が噛み合ってないですね。 FV300/500 のカタログに載っているダイアグラム（４ページ）を使って説明されてはいかがでしょうか。 カタログは http://www.olympus.co.jp/jp/lisg/bio-micro/product/fv300/fv300_su.cfm からダウンロードできます（要登録） http://www.cris.hokudai.ac.jp/openfacility/catalog/01_305_fv300.pdf にも同じものがあります。 FV300 で交換可能なのは励起用のダイクロイックミラー（図の６番）ですが、POM さんはこれを交換されているということで間違いないですか？毎回ふたを開ける必要があるんじゃないかと思いますが。もしそうだとすると、けいさんがおっしゃるように 505 を使わないと FITC の蛍光は見えない事になりますね。Mirror などという選択肢があるのが理解できないですが。 一方、仮に FV500 を使っているとすれば、これはチャンネル毎にダイクロイックミラーを使って出てきた蛍光を分けているので、Ch1 に割り振られたダイクロイックミラーは 570 にしないと Ch1 で FITC の蛍光は見えないことになります。例えば改良型 FV300（存在するのかどうか知りませんが）を使っておられて、蛍光をビームスプリッタでなくダイクロイックミラーで分けるようなものであれば 570 を使うこともあり得るでしょう。 ですから単にダイクロイックミラーは 505 がいいのか 570 がいいのかと尋ねられても、機器によって違うとしか言いようがありません。 励起レーザーからディテクタに至る過程で、どういうデバイスがどういう順番で現れるのかを順を追って説明されれば皆が共通の理解に至れると思います。

(無題) 削除/引用 No.2392-12 - 2008/11/27 (木) 19:09:31 - けい まず，わかり難いコメントですみません． 選択されているダイクロイックミラーは正しいのでしょうか？ 505のダイクロイックミラーだと思っているけれど実際は570のダイクロイックミラーではないかということです． もう一度書きますが，FV300の測定原理（光学系）は理解されてますか？ 505（と570）のダイクロイックミラーはどこに位置していてどういう役割をしているのかを考えてください． このダイクロイックミラーは励起光を試料の方向に反射する役割と 励起光が試料にあたって出てきた蛍光を透過する役割があります． このとき505のダイクロイックミラーであれば505以上の蛍光を透過し， 505より短い蛍光と試料にあたって反射した励起光などをカットする役割があります． ダイクロックミラーを透過した蛍光はビームスプリッタでCh1またはCh2の方向振り分けられます．単に振り分けているだけだと思います． そして振り分けられた蛍光が吸収フィルターを通過してCh1またはCh2の検出器で検出するということです． たとえば，FITCの場合， １．488の励起波長が505ダイクロックミラーで反射して試料に当たる． ２．520をピークとするFITCの蛍光が出る． ３．505ダイクロックミラーで505以上の蛍光が透過する． ４．透過した蛍光はビームスプリッタでCh1へ振り分けられる． ５．振り分けられた蛍光は（510-550）の吸収フィルターを通過して検出器で検出する． 505ダイクロックミラーとCh1(510-550：FITC)の組合せが正しければ観察できるはず．ですが実際には観察できていないのだから，組合せに問題があるのではと考えられます． だから，ＰＯＭさんのお使いになっているセッティングを確認してくださいということです．正しい位置に必要とするダイクロックミラーや吸収フィルターは取り付けられているのかなどを．

(無題) 削除/引用 No.2392-11 - 2008/11/27 (木) 18:57:54 - K 励起波長　最大蛍光波長 DAPI360nm　　　460nm FITC488nm　　　520nm Cy3552nm　　　580nm DAPIとFITCを同時に観察するときは、505のダイクロイックミラーを使い、CH1でDAPIの蛍光を、CH2でFITCの蛍光を観察する。 FITCとCy3を同時に観察するときは、570のダイクロイックミラーを使い、CH1でFITCの蛍光を、CH2でCy3の蛍光を観察する。 ということではないでしょうか？

？？？ 削除/引用 No.2392-10 - 2008/11/27 (木) 17:20:50 - POM naさん、おっしゃる通り、FV300でした。ありがとうございます。 けいさん ＞ＰＯＭさん，FV3000の測定原理，つまり光学系，を確認しましたか？ もう一度，確認してください． 特にダイクロイックミラーの位置を． 位置というのはどういう意味でしょうか？スライダの位置といういみでしょうか？あるいは、 傾向の光が通過してくる順番のことをおっしゃっているのでしょうか？ それならば、励起されて出たすべての波長の光が �@ダイクロイックミラーで短波長側と長波長側に分類（SDM505であれば、505より短い波長がCH1へ、長い波長がCH2へ） �ACH1、2の吸収フィルタで取得したい波長の光を選択 ということでしょうか。 ＞書き込みの中の「505」と「570」とを置き替えて考えてみたらどうでしょうか これはどういうことなのかよくわかりません。つまり、僕の考え方が間違っているということなのでしょうか？ ＞強いレーザー の意味は、出力を上げたレーザーという意味です。SDM505とBA505-525の組み合わせでは、FITCを励起させるレーザー出力をかなりあげてるとバックグラウンドが荒いぼんやりした像は得られますが、これは原理からして間違っているという考えなのですが、なぜかダイクロは505に固定するという張り紙がしてあります。付属の説明書には、ダイクロイックミラーが570と630の写真が載っており、当研究室ではほとんどの場合DAPI,FITC,Cy3しか用いないので、505のダイクロイックミラーが入っている意味がよくわかりません。今は505のダイクロイックミラーは僕自身全く使っていないのですが・・・。

(無題) 削除/引用 No.2392-9 - 2008/11/27 (木) 14:30:01 - けい ＞　�A励起波長は別で、FITCは488、Cy3は552です。 訂正していただきありがとうございます． ＰＯＭさん，FV3000の測定原理，つまり光学系，を確認しましたか？ もう一度，確認してください． 特にダイクロイックミラーの位置を． ＰＯＭさんの書き込みの中の「505」と「570」とを置き替えて考えてみたらどうでしょうか？ ＞　�@505のダイクロイックミラー（SDM505)＋CH1 バンドパスフィルタ（BA505-525) ＞　→観察できない（強いレーザーで非常に荒い画像） これが意味するところは，蛍光が弱すぎるのでゲインが高くなりノイズが多いということですか？ 「強いレーザー」の解釈がわかりません．

(無題) 削除/引用 No.2392-8 - 2008/11/27 (木) 13:37:04 - na FV300と違いますか？

訂正 削除/引用 No.2392-7 - 2008/11/27 (木) 11:19:43 - POM ありがとうございます。けいさんのレスで一部誤解を招いていると思いますので訂正ですが、 �@FITCとCy3の2重染色 �A励起波長は別で、FITCは488、Cy3は552です。 それで、 �@505のダイクロイックミラー（SDM505)＋CH1 バンドパスフィルタ（BA505-525) →観察できない（強いレーザーで非常に荒い画像） �A570のダイクロイックミラー（SDM570)＋Ch1 バンドパスフィルタ（BA505-525) →きれい �BCy3に関してはどちらもそれほど変わらなくきれいな画像（CH2: BA565IF) となります。 それで、僕の質問としては、�@の状態であると、FITCで染色で来ていると仮定した場合、 �@488で励起させるので、520前後の蛍光波長が得られる �A�@から考えると、BA505-525でFITCの蛍光を拾うにはダイクロイックミラーが505であると、505より長い波長の光は透過し、Ch2へ流れてしまうので、観察できるはずはない。570のダイクロイックミラーを挿入すると、CH1のBA505-525 でFITCの蛍光を拾うことができる。 と考えているのですが、当研究室では、購入した時の講習会(?)で、「FITCとDAPIはダイクロイックミラーが505」と、習ったことになっており、そういう張り紙までしてあります。僕はどう考えても、おかしいと思っているのですが、おかしいのは僕の方でしょうか。505だとDAPIはOKですが、FITCはだめだと思ううのですが･･･ この考え方で間違ってないですよね･･･

(無題) 削除/引用 No.2392-6 - 2008/11/27 (木) 00:48:22 - けい２ POMさんの測定条件が正確にはわからないのですが 　１．FITCとCy3の2重染色 　２．励起波長は同じ と仮定した場合 POMさんのいっていることは 　505のダイクロイックミラー + Ch1フィルター（510-550） 　　　　→　観察できない 　570のダイクロイックミラー + Ch2フィルター（？ 550以上の波長域？） 　　　　→　観察できる ということになるのだと思うのですが，どこか間違ってますか？ FITC染色できていると仮定する場合，なぜ505のダイクロイックミラー + Ch1フィルター（510-550）でFITCの蛍光イメージを観察できないのかを考えてください．おのずと観察できない理由が見つかるはずです． 指導してくれる人が周りにいなくて大変かもしれませんが，がんばって測定原理をしっかりと理解してください．

(無題) 削除/引用 No.2392-5 - 2008/11/26 (水) 13:13:27 - t6 FV3000はホームページで見つけられなかったのでわかりませんが、高スペックな共焦点になると内部に複数のフィルタおよびダイクロが入っているかと思います。 励起光を試料に導くために505のダイクロを使い、得られた蛍光を505以上のもののみにします。その蛍光をさらに570のダイクロで分割すればよいかと考えます。 これにより505-570の範囲の蛍光をCh1(510-550：FITC)で検出、かつ570以上の蛍光をCh2(575LPとか：Cy3の裾）で検出でき、同時観察になるかと思います。 検出チャネルが2個あるようなので第2ダイクロも設定できると思うのですが。

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