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(無題) 削除/引用 No.239-8 - 2007/10/10 (水) 21:38:40 - plant ころんさん、レスありがとうございます。 > 私もたまに一日に同じものを何度も回すと、ネガティブコントロールに、陽性バンドが検出されて困ったことが何度もあります。私の場合はダイマーでなく目的のサイズですが。。。 なるほど、エアロゾルによるコンタミを考えてらっしゃるのですね。 確かに、がんがんPCRをかけているとPCR産物がエアロゾルとなって空気中に浮遊する（？）という話は訊いたことがあります。しかしそれがどれくらいcriticalなものなのかはちゃんと追求したことはないです。PCRをかける部屋は独立に設けているラボもあるらしいですが、それほどの余裕はないですし…。困りものですね。 > Primarも私の印象以上に丈夫らしく4℃で1-2年放置してもPCRがかかると聞いたことがあります。私の周りのラボの方々はReal-time PCR用のPrimerを4℃保存しています。 4℃は驚きですね！　うちのラボでは代々-20℃に凍結しています。しかもその溶液を使う度に凍結／融解繰り返しているので、プライマーにとってはベストと言えない保存方法かも。

(無題) 削除/引用 No.239-6 - 2007/10/10 (水) 16:22:02 - ころん 私もたまに一日に同じものを何度も回すと、 ネガティブコントロールに、陽性バンドが検出されて困ったことが何度もあります。私の場合はダイマーでなく目的のサイズですが。。。 こちらのサイトでも何度もネガティブコントロールの偽陽性バンドについてトピになっていて、私の印象だとPrimerデザインもあるかも知れませんが、PCRをまわすと空気中にDNAが舞う？が要因ではないかと思っております。 そのトピでの対策は、ピペットのコンタミを気をつける、PCR装置と電気泳動を異なる部屋で行う、反応液の調整をベンチ内で行うなどがあげられていました。 Primarも私の印象以上に丈夫らしく4℃で1-2年放置してもPCRがかかると聞いたことがあります。私の周りのラボの方々はReal-time PCR用のPrimerを4℃保存しています。 私はPrimerの精製グレードについて細かく比較したことがないですが、配列がしっかりしていればそれほど差が出る感じはしませんでした。 むしろ、デザインしなおしたほうが安上がりと思います。 参考までに。

(無題) 削除/引用 No.239-5 - 2007/10/10 (水) 12:02:20 - plant Sさん、mugimakiさん、レスありがとうございました。 > リアルタイムPCRはかなりsensitiveな実験のようなのでちょっとしたことで非特異増幅などが起こるようです。 確かに私もそれを感じております。例えばリアルタイムPCR装置を何度も続けて稼働させている状態と、その日最初のランとでは、ダイマーの出来やすさに違いが感じられるのです。もちろんブロックの温度はいつでもきちんと制御されているはずですが、機械内の空気の温度？などの微妙な差異が、ダイマー形成形成のトリガーとなりうるのではないかと思っています。 > Ｓさんがおっしゃられているようにprimerの濃度をふってみてはいかがでしょうか。 初めて使うプライマーは、ABIのテクニカルマニュアルに載っているプロトコルで最適プライマー濃度を調べています。（Foward，Reverseそれぞれ、50nM，300nM，900nM＝合計9通りの組み合わせを試しています。）しかしその結果、最適だとわかったプライマー濃度を使っていても、ときどきダイマー形成してしまうことがあるんですよね。 > 当方ではprimerはコンピューターでのシミュレーションにて検証した後実際のReal timeを行っています。コンピューターの予測で10kcal以上の熱量でprimerどうしが結合する場合はReal timeで使用しておりません。 かなり本格的なプライマー設計をされているんですね。正直言って、うちのラボにとっては敷居が高いレベルなので、そこまでは試せそうもありませんが…。 あと、全く同じ配列であってもプライマーの合成業者（あるいは精製グレード）によってダイマー形成のしやすさが変わったりすることはあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.239-3 - 2007/10/10 (水) 10:15:51 - mugimaki 当方real time RT-PCRを少々扱っております。 Ｓさんがおっしゃられているようにprimerの濃度を ふってみてはいかがでしょうか。 当方ではprimerはコンピューターでのシミュレーションにて検証した後 実際のReal timeを行っています。コンピューターの予測で10kcal以上の 熱量でprimerどうしが結合する場合はReal timeで使用しておりません。 （一般のFreeのsoftでこれが計算できるものを当方は知りません ごめんなさい） （かなりprimerの設計は難しいと思います。PCRで問題ないpairでも かなり場合10kcal以上になってしまいます） その上で、primerの濃度を0.3uM、0.6uM、0.9uMと３段階にふって 検証しています。 参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.239-2 - 2007/10/09 (火) 11:29:43 - S 私もABI7300、SYBRでリアルタイムを行っていますが、同じような経験があります。一度は最適化した実験系でダイマーが増幅したりということです。 私の場合はSYBRの劣化が原因のようでした。実験を最適化したときの試薬が劣化していて検出力が落ちていて、その後新しい試薬を使用したときに検出力が上がったことでダイマーが検出されたようです。古い試薬と新しい試薬で同時にランしたときも新しい試薬でのみダイマーが検出されました。 リアルタイムPCRはかなりsensitiveな実験のようなのでちょっとしたことで非特異増幅などが起こるようです。そもそもダイマーができるギリギリの実験系だったのでは？解決方法はプライマー濃度を下げることになると思いますが、少し余裕を持たせた系を確立することをお勧めします あまり疑問に答えられていないかもしれませんが、何かのご参考になれば幸いです。

リアルタイムRT-PCRのPrimer Dimer 削除/引用 No.239-1 - 2007/09/23 (日) 23:43:37 - plant リアルタイムRT-PCRで、遺伝子発現の定量をやっている者です。 （ABI 7300，絶対定量，SYBR green PCR master mixを使用） 最近不可解な現象に悩まされております。 プライマーを設計して、到着と同時に、Primer Dimerができないかどうかまずリアルタイムをかけてみます（NTCとUnknownウェルのみで）。その結果、Dimerが認められなかったプライマーペアについては、スタンダード作製を行い、いよいよ実際のサンプルをリアルタイムにかけて絶対定量を行うわけですが、数回ランを繰り返していくうちにNTCにおいてPrimer Dimerとおぼしき増幅が起こるようになってきます（Dissociation Curveより推定）。はじめは、NTCのトリプリケート間でもDimerができるウェルとできないウェルが混在するのですが、回数を重ねていくうちにNTC全ウェルでDimerができるようになってしまいます。もちろんこのプライマーは、到着当初はDimerができなかったペアです。 プライマーの凍結融解を繰り返すと良くないということはしばし聞きますが、昔からラボのフリーザーに保存されているプライマーなどはそれこそ何回も凍結融解をしているのにも関わらず正常にリアルタイムができることをふまえると、いまいち納得ができません。 時間経過に伴って、PrimerのDImerizationが起こりやすくなるといったことはあり得るのでしょうか？ 念のためPrimerの精製度を高めて（HPLC 精製）みましたが、時間経過と共に問題が発生するという傾向は変わりませんでした。

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