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(無題) 削除/引用 No.2380-10 - 2008/11/27 (木) 20:29:00 - DC 単純に抗His抗体と抗目的タンパク抗体のアフィニティーや特異性の違いなのでは・・・ His抗体はもともとのアフィニティーが弱いためにIPTG添加前では目的タンパクがあっても検出できず、 目的タンパク抗体はアフィニティーが強いために、少量のタンパクまで検出できている、というだけではないでしょうか・・・

(無題) 削除/引用 No.2380-9 - 2008/11/25 (火) 01:39:37 - おお >[Re:8] ゆうさんは書きました : > 抗His抗体を用いるとIPTG誘導前はバンドは検出されず誘導後検出されるのですが、目的のタンパクに対する抗体の場合、IPTG誘導前後ともほぼ同じ太さのバンドが検出され差はないと思われます。 これはちょっと困りましたね。HISで誘導がかかってそのタンパクが発現しているだろうとは思いますが、、抗体が非常に感度よくてバンドがサチュレーションおこしているんでしょうか、、、、 いちど、空のベクターをBL21にいれて、大腸菌が同様のコンディションでその抗体で認識される物が発現しているか確認されてはどうでしょうか。 偶然何か大腸菌由来のタンパクを認識しているようであればHISの抗体で精製をおうのがいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2380-8 - 2008/11/24 (月) 22:37:16 - ゆう 抗His抗体を用いるとIPTG誘導前はバンドは検出されず誘導後検出されるのですが、目的のタンパクに対する抗体の場合、IPTG誘導前後ともほぼ同じ太さのバンドが検出され差はないと思われます。

(無題) 削除/引用 No.2380-7 - 2008/11/24 (月) 22:30:46 - 通りすがり 誘導前と誘導後に量の差はあるんですか？

(無題) 削除/引用 No.2380-6 - 2008/11/24 (月) 21:08:13 - ゆう みなさまのご意見、大変参考になりました。 ところで、 ＞抗His抗体を用いると、IPTGを添加したレーンにのみバンドが出て、添加前のレーンにはバンドが検出されないのですが、目的のタンパクに対するモノクローナル抗体を用いると、IPTG添加前のサンプルにもバンドが検出されてしまいます。バンドの高さは両方の抗体とも同じ18ＫDaです。この結果の違いはどういうことを意味していると考えればよいのでしょうか。 この疑問についてどなたか教えていただけますでしょうか？ His抗体ではIPTGでタンパク誘導がかかっている結果が得られているので、目的のタンパクに対するモノクローナル抗体自身に問題があるかとも思い、別の抗体で再度確認しようかとは思っているのですが。

(無題) 削除/引用 No.2380-4 - 2008/11/22 (土) 05:23:37 - 通りすがり Massが一番正確でベストだと思いますが、もしおっくうだとか、大体正しければ良いというのであれば、、、 Hisで精製してらっしゃるので、多分、分解が起こっているとすれば逆サイドでしょう。 オリジナルと精製物では分子量にして3 Kの違いがあるので、仮にC末端が切られているとすると、 目的タンパク質のCターミナルdeletionを1から2 Kの範囲で作ったとしても恐らくは、やっぱり 18 kDaのタンパク質が出てくると思います。これが一つ。 あとは、NがHis、CがFLAGとかで2 round purificationすると全長がとれてきます。

(無題) 削除/引用 No.2380-3 - 2008/11/22 (土) 04:39:48 - おお 気軽にマスという時代になってしまったんでしょうか、、、 まずやっていると思いますが、プラスミドの配列は確認されたでしょうか? それで理論的にその遺伝子のORFがタンパクに翻訳されるようになっていれば まずOKとしていいと思います。で、N末やC末の抗体があれば(なくても なにか特異的な抗体)スペシフィックであることがさらに確認できると思います(てっかそこまではやってますね)。 >過去の文献および抗体の添付書では21KDaあたりにバンドが認められています。 これは単純に比較できないと思います。 文献や添付文書に示してあるサンプルを同時に流せますか? それらはリコンビナントですか?リコンビナントならタグは何ですか? マーカーが違えばサイズがぶれることもあります。 リコンビナントと従来発現している物から取ったサンプル でも違いがあることがあります。 6xHISは一般的に移動度が遅くなる傾向がありますが、早くなる可能性も否定できません。

(無題) 削除/引用 No.2380-2 - 2008/11/22 (土) 01:48:03 - 名無し とりあえずそれっぽいものは発現してそうなのだから、とりあえず、誘導かけた大腸菌ライゼートをNi-カラムに通して、His-tag タンパク質を取ってきて(抗体が反応してるのだからたぶんなんかとれてくるはず）、massかN-末シークエンスなんかで同定してみるのが早道と思う。べつにLC/MS/MSでやらなくても、とりあえずMALDI-TOFで分子量測定してみてほぼ6xHis+目的タンパク質の分子量になってれば安心できるでしょう。もし値が変でも分子量とアミノ酸配列からどのへんが欠けたとか類推できるし損はないと思う。これはものすごく簡単ですぐ終わる実験だからMALDI-TOF持ってるところに頼んで何かのついでにやってもらえばいいと思う。 SDS-PAGEはあくまで見かけの分子量だからアミノ酸組成のかたよりとか、SDSとの相性とかいろいろなことで理論値と合わないのもそんなに珍しいことではないです。

精製中のタンパクが目的の分子量に合わず困っています。 削除/引用 No.2380-1 - 2008/11/22 (土) 00:38:21 - ゆう 現在BL21を用いてHis-tag融合タンパクの精製を行っています。 精製中のタンパクが目的の分子量に合わず困っています。 　 　目的のタンパクの分子量は21KDaなのですが、westernを行ったところ、抗His抗体を用いても、目的のタンパクに対するモノクローナル抗体を用いても、１８Kdaのみに濃いバンドが検出されました。過去の文献および抗体の添付書では21KDaあたりにバンドが認められています。 　アミノ酸配列をみると最初のメチオニン以外にN末付近と中央あたりに３箇所メチオニンが存在するのですが、コーディングがこれらのメチオニンからスタートしてしまって分子量が小さくなってしまっているということは考えられるのでしょうか？（ただ、その場合バンドが１つしか検出されないのが不思議なのですが。） また、もう１つ質問なのですが、抗His抗体を用いると、IPTGを添加したレーンにのみバンドが出て、添加前のレーンにはバンドが検出されないのですが、目的のタンパクに対するモノクローナル抗体を用いると、IPTG添加前のサンプルにもバンドが検出されてしまいます。バンドの高さは両方の抗体とも同じ18ＫDaです。この結果の違いはどういうことを意味していると考えればよいのでしょうか？

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