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(無題) 削除/引用 No.2377-9 - 2008/11/21 (金) 23:10:43 - Fish こういったキットを使用することは検討されましたか？ http://app.roche-biochem.jp/catalog/index.php/product_3.6.8.50.1.1.html ドライアップの必要は無いので、溶けない悩みは生じないと思いますが。 ただ、50μlの溶出なのでRTが2−5μｌというのが増えると思いますが、 回収量がUpすればメリットはあると思います。 また、キャリアーとしてtRNAを使用する事でロスを減らすことが出来ます。 http://app.roche-biochem.jp/catalog/index.php/product_3.6.2.3.1.1.html

(無題) 削除/引用 No.2377-8 - 2008/11/21 (金) 19:53:06 - ~ >RNA pelletというのはどの程度のものをおっしゃっていますか？ たしか50~数百ugぐらいだったと思います。 株化細胞を使っているため、あまり微量なサンプルは扱っていません。

多糖類？ 削除/引用 No.2377-7 - 2008/11/21 (金) 19:06:17 - mom-a total RNAとして1ug以下〜30ugくらいまで色々やりましたが、普通に10uLのDWにとけました。（爪楊枝の先端の大きさがイメージしずらいですが、30ugは結構な量です）10min程度放置してもちゃんと溶けましたが、乾燥しすぎを気にするなら、ペレットが大きいと、乾燥するにつれて端の方から透明っぽくなって見えにくくなる感じで、そうなったら溶解しても構わないといわれました。 私ではないですが、いやにペレットが多いな、と思っていたら溶けきらなかった人がいましたが、これは添加した多糖のせいだったようです。

(無題) 削除/引用 No.2377-6 - 2008/11/21 (金) 18:44:42 - AP 一般論ですが、RNA沈殿が溶けにくいときは、 ・50-65℃くらいに温める。 ・DWではなくTEにとかす（二価金属イオンが存在すると難溶となるのでEDTAが有効、EDTAを避けるとしてもpHが低いと溶けにくいのでバッファーした方がよい。RNase-free Tris bufferが準備できない場合はDEPC処理したHepes bufferで）。 ・downstreamに影響がなければ0.1%くらいのSDSを添加する。 Trizol（AGPC法）ではRNAと一緒に多糖類が共沈しやすく、これが沈殿を溶けにくくさせる場合があります。培養細胞でそれほど問題になるとは考えにくいですが、プロパノール沈殿の改良法で多糖類の共沈を防ぐ方法があります。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;start=4;Code=784

(無題) 削除/引用 No.2377-5 - 2008/11/21 (金) 18:43:46 - Trizolで失敗続き pumpkinさん ありがとうございます。 >私の場合はペレットが十分量得られることが多いので、300uL程に溶解しているのでその影響が少ないのかもしれません。あまり少量に溶かすといけないかもしれません。 300 ulに溶かせば問題ないかもしれませんが、私の場合、爪楊枝の先端のRNA pelletを12-20 ulで再溶解させ、その後、2-5 ulをRTします。 ~さん ありがとうございます。 >80%エタノールで洗って上清をピペットマンで除いて、 さらにもう一度遠心して、壁面に付いていたエタノールを落として除いたら、 私も今後、そのように行ってみます。 ~さんのRNA pelletというのはどの程度のものをおっしゃっていますか？ 爪楊枝の先端くらいでしょうか？？ 質問ばかりで申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.2377-4 - 2008/11/21 (金) 18:38:56 - fish よく乾かしすぎると駄目とありますが、 完全に凍結乾燥させるわけでもないので、溶けなかったことはないです。 50度 5minであっためて溶かしますけど。

(無題) 削除/引用 No.2377-3 - 2008/11/21 (金) 17:36:15 - ~ 私は乾燥はさせていません。 80%エタノールで洗って上清をピペットマンで除いて、 さらにもう一度遠心して、壁面に付いていたエタノールを落として除いたら、 （遠心前は見えないのですが、結構出てきます） そのままTEなどで溶解させています。

(無題) 削除/引用 No.2377-2 - 2008/11/21 (金) 15:08:16 - Pumpkin 乾かし過ぎではないですか？他のトピックにもありますが、乾燥させすぎで溶解できなくなっている意見をよく耳にします。Trizolで失敗続きさんのおっしゃるように、私は70%リンスした後にぎりぎりまでエタノールをピペットマンで吸い出したら（さらに軽く遠心して除くこともある）、バッファに溶かしてしまいます。いわゆる風乾という工程はしません。エタノールはダウンストリームの反応を悪くするといわれますが、今まではそのように感じたことはありません。とはいえ、私の場合はペレットが十分量得られることが多いので、300uL程に溶解しているのでその影響が少ないのかもしれません。あまり少量に溶かすといけないかもしれません。 あとは、多糖の混入はないですか？多糖が多いと、難溶性沈澱として得られ溶けないのですが、見た目RNAと区別もつきません。これも多糖の多い生物だと割とよく起こります。

RNA pelletの乾燥が早すぎてDWに溶けません… 削除/引用 No.2377-1 - 2008/11/21 (金) 13:32:46 - Trizolで失敗続き 現在、RNA抽出を始めたものです。 初代培養を行っており、ごく微量な貴重サンプルからRNA抽出を試みておりますが、Trizol抽出後、イソプロ沈、エタチン後にdry upさせ、DWで再溶解してODを測定しております。 が、エタチン後、爪楊枝の先端ほどのpelltが出来ているのを確認して、ピペットマンでほとんどのエタノールを除去して、5-6 min dry up後、DWに溶かしますが、ちゃんと溶けきれずODが測定できない場合があります。 個人的にはピペットマンでギリギリまで吸っているので、dry upもさほど気にせずDWで再溶解してもいいんじゃないかと思うようになりました。 皆さんはこの意見に関してどのように思われますでしょうか？

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