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(無題) 削除/引用 No.2374-15 - 2008/12/04 (木) 12:59:07 - おお >[Re:14] TSさん ありがとうございました。あげるタイミングみてたりして、 お礼遅くなってます、、、 > 私のIPのスタンダードプロトコールは、こんな感じです。 わたしのものに可也近いです。 > マグネットタイプのもに変えたところ、大きく改善しました。 わたしもそう思って、ここで１度そういうアドバイスをした ことがあるのですが、その時は改善しなかったようです。 でもやってみる価値はありますよね。 > ビーズを洗浄するときに遠心分離が必要ないので、途中のトピに書かれていたような、夾雑物のコンタミというのが少なくなったのもあるかもしれません。 なるほど!そういう解釈もありますね。

私のIP 削除/引用 No.2374-14 - 2008/12/01 (月) 15:43:32 - TS 私のIPのスタンダードプロトコールは、こんな感じです。 1.　0.5-1 mg protein/0.8 mLに抗体を2-3μg添加 2.　ローテーターで、インキュベーション、４℃、一晩 3.　50% protein A（セファロース）を25μL添加し、 　　インキュベーション、４℃、１−２時間 4.　洗浄（IPに使用したバッファー）、１ｍLで４回 5.　20μLの2Xサンプルバッファーで溶出 以前、どうしてもセファロースにくっついてしまうタンパクがあって困ったことがありました（一次抗体なしでも落ちてきてしまう）。このときは、担体をセファロースではなく、マグネットタイプのもに変えたところ、大きく改善しました。そのタンパク質が、マグネットにくっつきにくかったこととが大きいと思いますが、ビーズを洗浄するときに遠心分離が必要ないので、途中のトピに書かれていたような、夾雑物のコンタミというのが少なくなったのもあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2374-13 - 2008/12/01 (月) 13:43:49 - 細胞でのIPは経験済み >おお様 目的とする組織は骨格筋です。 骨格筋を破砕した後、核を単離したいので、 組織は破砕されるが、核は破砕されないような条件でできれば理想です。 ホモジェナイザーもDounce型やポリトロン型などがありますが、破砕の強さは大きく変わるのでしょうか？ご存知でしたら教えていただければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.2374-12 - 2008/12/01 (月) 13:33:42 - おお >[Re:10] 細胞でのIPは経験済みさんは書きました : > 組織からのIPを行いたいのですが、組織の粉砕方法で悩んでいます。 組織はどの組織でしょうか。 柔らかい組織なら、弱くてもそんなに 支障はないです。もちろん、ターゲット にもよってくるだろうとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.2374-11 - 2008/12/01 (月) 12:21:17 - EcoRI 私の経験では、ProteinA/Gを使うと、酸溶出のときに、抗体が落ちて来てしまって、 PAGEが見にくい、ということがありました。 カップリングさせるにしても、Sepahrose担体を用いて繰り返しIPすると、 酸でSepharoseが分解されて、単糖末端が露出するのか、レクチンがくっついてきたこともあります(N末とって確認しました) 炭化水素鎖ベースの担体、というのも選択肢にあるように思います。

(無題) 削除/引用 No.2374-10 - 2008/12/01 (月) 11:23:28 - 細胞でのIPは経験済み 横レスで申し訳ないのですが、IPをやっている方が多く見られるようなので教えてください。 組織からのIPを行いたいのですが、組織の粉砕方法で悩んでいます。 組織の粉砕方法としては、 １、ホモジェナイザーによる粉砕 ２、乳鉢ですりつぶす ３、ジルコニアビーズを使った粉砕 等を考えています。 粉砕の強さは３＞２＞１なのですが、 懸念しているのは粉砕が強すぎる場合、タンパク質間相互作用が保たれているのかということです。 かといって粉砕を弱くするとタンパク質の抽出効率が悪くなるため、最終的にIP効率もおちるように思います。 組織からIPを行ったことがある方がいらっしゃいましたら、アドバイスをいただけないでしょうか？ よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2374-9 - 2008/12/01 (月) 07:57:39 - おお あなたのIPのご経験、気がついたことなどコメントください とりあえず(しつこく)アゲです。

(無題) 削除/引用 No.2374-8 - 2008/11/26 (水) 13:57:52 - おお >[Re:6] Aさんは書きました : > それほど経験ありませんが私がIPを行う時はバイオラッドのアフィゲルHz > に抗体をカップリングさせて行っています。 カップリングというのは確かに賢い選択かもしれませんね。 ただ面倒なのでどうしてもA/Gビーズとかに抗体混ぜてしまいます、、、 > >ビーズの洗いは何回ですか? > ビーズは大抵少量ですからサンプルに問題のないバッファーで15mLx4です。 15mlは大きいスケールですね。マスに持っていくとかでしょうか。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2374-7 - 2008/11/26 (水) 13:53:28 - おお >[Re:5] 怠け者さんは書きました : > 質問の答えと直接関係ないですがちょっと関連するとおもったのでこのまえ気がついたことを書きます。自然沈降するような重いprotein Aビーズを使って一貫して遠心なしでＩＰ実験するとバックグラウンド結構減りました。 あ、これなんか分かる気がします。そういう場合は IPの前にフィルターがいいかもしれませんね。 IP前に3-40000g位の遠心をやればいいでしょうけど、、 超遠心というのもたまに聞きますが、、、 そういうのって場所によってはできない人もいますし、、、 >あとビーズへの非特異的吸着とかよくいわれますが、洗いの回数ふやしたりとか、ちゃんとプレクリーニングしても期待したほどそんなに改善しなかったし、かえって回収率悪くなったりしたこともあったし。 非特異的吸着って意外とひつこいですよね。困ることがたしかにあります。 グリセロールなのでも防げるものがあるようですが、 経験的にはそんな劇的に変わらないですね。 IPしてWBだけの実験ならビーズを通常の1/3とか1/5にへらして、 なんとかしのぐと言うのも場合によっては可能かと、、、

(無題) 削除/引用 No.2374-6 - 2008/11/26 (水) 01:44:13 - A それほど経験ありませんが私がIPを行う時はバイオラッドのアフィゲルHz に抗体をカップリングさせて行っています。これは以前ProteinGだったか Aだったかを使ってIPを行ったところ条件検討が十分でなかったのかバック が高かったためです。ですから >IPは抗体をいれて、物と反応させてから行ってますか? プトロコール上この状況はありません。 >IPまたは抗体反応は室温ですか、4度ですか? 4度でローテーターでゆっくり回します。 >IPはA/Gビーズなど入れてから何時間インキュベーションしていますか? 基本２時間です。条件によってはオーバーナイトもやるかもしれません。 >IPのときDTTや2-MEをくわえますか? 加えていません。 >ビーズの洗いは何回ですか? ビーズは大抵少量ですからサンプルに問題のないバッファーで15mLx4です。 >Glycerol添加 してないです。

(無題) 削除/引用 No.2374-5 - 2008/11/21 (金) 17:10:45 - 怠け者 質問の答えと直接関係ないですがちょっと関連するとおもったのでこのまえ気がついたことを書きます。自然沈降するような重いprotein Aビーズを使って一貫して遠心なしでＩＰ実験するとバックグラウンド結構減りました。インキュベート中にアグッて溶けなくなったりした（しかし目にはほとんど見えないような微細なやつ）のとか、IP前の遠心で除ききれなかったほんのわずかの細胞のかすとか、混入した微細なごみみたいなのを遠心でビーズと一緒に集めてしまいそれがかなりBGになっているのかもとか思いました。あとビーズへの非特異的吸着とかよくいわれますが、洗いの回数ふやしたりとか、ちゃんとプレクリーニングしても期待したほどそんなに改善しなかったし、かえって回収率悪くなったりしたこともあったし。

(無題) 削除/引用 No.2374-4 - 2008/11/21 (金) 11:24:55 - おお >[Re:3] りょうさん ありがとうございました。 > 初めに、目的により各段階の方法をadjustします。 > でも感覚的なものなので、いつもそれがベストなのかは疑問に思いつつ目的を果たしている感じです。 そうですよね。最初に条件を合わせるというのが手探り的なとこがある のと、検出できればいいのでベストをいつも探してからやっているか というと、皆さんそうではないだろうと感じますね。 文献に同様のタンパクでの条件が発表されている時はもう少し やりやすいかも知れません。 > > 僕の一般的な方法は、washしたproteinG-Sephにタンパク抽出物・抗体を混ぜて、タンパク終濃度1-2mg/ml程度にメスアップして4度・時間は抗体の種類に依存しますが最低3h-最高O/N。観覧車型のrotatorでゆっくり回転させています。 抗体とビーズはほぼ同時にほりこんでいるわけですね。私もそちら派です 最近気分的に抗体入れてからしばらく置いてます。 インキュベーションは最低3じかんですか。たしかにそれくらいは必要かも しれませんね。私は過剰発現がおおいため2時間ぐらいで打ち切ることも おおいです。長すぎてもプロテアーゼのアタックも嫌かなと思ったり します(もちろんPIいれてますが)。 > washはlysis bufferと同じもので単にIP効率を検討する程度なら3回。 > 共沈(ノイズを抑える）なら最低4回できれば5回。 やっぱ4、5回は洗いたいと思いますね。 知り合いは最後だけLiCl 0.5Mのバッファーで洗う (もちろん抗体によりますが)といってました。 > 最後にもう一つ付け加えるなら、マス解析に回す場合などは数時間-O/NでIPした沈降物を新しいエッペンチューブに入れ替えます なるほど、これはRIのラベルとかのときやったりしますね。 感度が上がるとそういうのも無視できなくなりますね。 > ＊＊＊質問項目にGlycerol添加の必要性も加えさせてください。＊＊＊ > 乱文ですみません。 Glycerol添加もたしかに選択肢ですね。入れて悪いことはあまり しないだろうなと思えるのですが、入れても改善しなかった ことはあります。 みなさんグリセロールについてどうされているかも、 差し支えなければ教えてください。

(無題) 削除/引用 No.2374-3 - 2008/11/21 (金) 10:48:29 - りょう 初めに、目的により各段階の方法をadjustします。 でも感覚的なものなので、いつもそれがベストなのかは疑問に思いつつ目的を果たしている感じです。 僕の一般的な方法は、washしたproteinG-Sephにタンパク抽出物・抗体を混ぜて、タンパク終濃度1-2mg/ml程度にメスアップして4度・時間は抗体の種類に依存しますが最低3h-最高O/N。観覧車型のrotatorでゆっくり回転させています。 washはlysis bufferと同じもので単にIP効率を検討する程度なら3回。 共沈(ノイズを抑える）なら最低4回できれば5回。 還元剤は大抵入れていません。 共沈物を網羅的にマス解析に回す時は1mM DTTや5-10%Glycerolを添加したりします。 これらの添加が果たして功を奏しているのかは不明。 「添加なしで確実にbindingしているでしょう」と思える結合蛋白も取れています。 最後にもう一つ付け加えるなら、マス解析に回す場合などは数時間-O/NでIPした沈降物を新しいエッペンチューブに入れ替えます（壁に少なからず吸着したタンパクが存在すると思うので、最後にSDS-sample bufferでboilした時にそれらも回収される気がするため）。 ＊＊＊質問項目にGlycerol添加の必要性も加えさせてください。＊＊＊ 乱文ですみません。

(無題) 削除/引用 No.2374-2 - 2008/11/21 (金) 07:39:40 - おお あ、加えます。ビーズの洗いは何回ですか?

IPのインキュベーションの時間 削除/引用 No.2374-1 - 2008/11/21 (金) 07:23:39 - おお 興味本位でお伺いしたいと思います。 皆様のやっている実験系でIPはどのようにやっているかということを 聞きたいと思います。アンケートみたいなものと思ってくださっても 結構です。なにか回答に理由とかあればさらにいいなと思います。 IPは抗体をいれて、物と反応させてから行ってますか? IPまたは抗体反応は室温ですか、4度ですか? IPはA/Gビーズなど入れてから何時間インキュベーションしていますか? IPのときDTTや2-MEをくわえますか? 私は1-2時間、4度でとくに抗体と物を先に反応させるという 意識はありません。2-MEはなるべく加えた方がいいように思うのですが そんなに気が進みません。

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