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(無題) 削除/引用 No.2372-12 - 2008/11/24 (月) 23:01:20 - あべちゃん みなさん、 色々とサジェッションありがとうございます。 蛋白質によってはDTTやｂMEで還元しきれないもの、そもそもSS結合ではなくとも強固に相互作用するもの、サンプルの抽出中の酸化によるアーティフィシャルな相互作用、泳動中の再酸化など色々と注意すべき点が、あぶり出され、助かりました。 本当にありがとうございます。 ちなみに、BisTris-SDS-PAGEの系では、再酸化を防ぐために5mM の sodium bisulfiteを泳動バッファーに使用しています。

(無題) 削除/引用 No.2372-11 - 2008/11/22 (土) 20:10:30 - 名無し すいません。ちがいます。はじめの質問の中にあった(DTT入り）というところと別のひとのレスポンスの60KDaというところと、それとは別のレスポンスの還元が不足ではというところとかが頭の中で混じってしまいまいました。 DTTとか再酸化がどうこうというのは学校で、DTTで還元したサンプルを冷凍していて時々出してきて電気泳動してたら、5回目とかそのくらいからだんだんバンドがボーっとしてスメアっぽくなって上の方とかにたまっている感じになってきて（bMEのときは時間たってもあんまりそういう風にならなかった）先生にきいたらそのサンプルにbMEいれてみなさいといわれてそれでβMEいれたら初め見たくまたバシッとしたバンドにになったことがあったので書きました。

(無題) 削除/引用 No.2372-10 - 2008/11/22 (土) 19:13:21 - おお >[Re:8] 名無しさんは書きました : > このことと関連して６０Ｋあたりのバンドが出たり出なかったりも気になります。 これは私のコメントについてでしょうか。 サンプルバッファーはDTTは使っていません、2ｰMEでやっていました。 このタンパク複合体は結晶化され構造解析が非常に昔になされ、ノーベル賞 の対象になっています。 構造的にはタンパク同士のSS結合は見つかっていません。 また、60kDaがボイリングでふえ尿素でへることは、このたんぱく質の 研究に携わるいろんなグループで確認されていて、共通の 認識になっています。

(無題) 削除/引用 No.2372-9 - 2008/11/22 (土) 15:59:59 - 通りすがり DTTは安定性が低いというのではなく、反応性が高いとした方が妥当かと思います。特にアルカリ側で活性は強くなり、強い還元性を示します。ですので、当然サンプルバーファーにDTTを入れると、きっちり還元してくれます。一方、bMEは安定ではありますが、当然ながらDTTと同じく反応後は活性を失います。bMEは還元力がDTTより大分弱いので、サンプル中のジスルフィドを切ろうと思うとかなり入れなければ駄目です。また、サンプルバッファー中にはSDSが入ってるので、再酸化によるアグリゲーションはほとんど考慮しなくて良いと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.2372-8 - 2008/11/22 (土) 14:50:44 - 名無し DTT入りさんぷるバッハはやばいです。べたMEと違い安定性が低いのでそんなにいつまでももたないです。それに加熱したらたぶん壊れます。たぶんそのサンプルバッファー中では還元は十分にいけてないと思います。（それかいったん還元されてもまた変な風にだんだん再酸化してしまってる）今もっているそのサンプルにべたME（ふぁいなる５ぱー）を添加してやり直してみたらどうでしょうか。このことと関連して６０Ｋあたりのバンドが出たり出なかったりも気になります。

(無題) 削除/引用 No.2372-7 - 2008/11/22 (土) 13:19:09 - 通りすがり もし加えられたDTTが1mMとか2mMなら、全てのタンパク質が還元されることはなく、 むしろ、それ以上の酸化を防ぐ程度にしか効かない可能性もあるので、サンプルバッファー中に、 終濃度が50mMから100 mMくらいになるまで入れて、完全に還元してみるのも手です。 50 mMでも怪しい時あります。

(無題) 削除/引用 No.2372-6 - 2008/11/21 (金) 15:51:23 - 怠け者 パブメドにSDS resistant oligomerとか入れてで検索するとけっこうそういう蛋白質はあるみたい。ただSDS耐性の強力な非共有結合なのか、アミノ酸側鎖同士の共有結合（チロシンとかアミノ酸側鎖が酸化されて２両体作るのとか、トランスグルタミラーゼの作用とか、アルデヒドとか、酵素的も非酵素的もいろいろあるとおもう）なのかを判別するのは結構難しい気がする。SDSを増やして長時間放置するとモノマーが少し増えるとかそういうことを示せばわかってもらえるかもしれないけどそんなのばっかでもないし。単に蛋白質量＞＞＞SDSのときもなるかもしれないし。

(無題) 削除/引用 No.2372-5 - 2008/11/21 (金) 12:47:54 - 千夏 Atg5-Atg12はheterodimerのままですねｖ

膜蛋白質 削除/引用 No.2372-4 - 2008/11/21 (金) 09:43:20 - あべちゃん おおさん、 ありがとうございます。 私の目的蛋白質は水溶性蛋白質ですが、細胞環境によっては膜蛋白質に結合します。 膜蛋白質をボイルすると可溶化するどころかアグルことがあるとは、ここの掲示板で以前勉強させていただきました。 目的蛋白質が膜蛋白質に取り込まれながらアグリゲーションを起こしたのかもしれないです。 あと、目的蛋白質はアンチパラレルのコイルドコイルによる分子間相互作用をすることが知られています。 コイルドコイルには強固なものがあるんですね。勉強になりました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2372-3 - 2008/11/21 (金) 02:57:52 - おお >[Re:2] おおさんは書きました : > このコンプレックスを単りして、Laemlliの電気えいどうのシステムで流すと、30kDaにダブレット、60kDaあたりにばんどが得られ、前者はD1とD2がバラバラになったもの、後者は両者のコンプレックス(またはアクリゲーション)ということが、抗体などを用いて示されています。 あ、因みにこの60kDaあたりのバンドはボイリングで増えます。ボイリングせず、ウレアを含むゲル、サンプルバッファーでながすと、60KDaは減ります(多分完全にはなくならない)。

(無題) 削除/引用 No.2372-2 - 2008/11/21 (金) 02:53:32 - おお 私の知っているものでは(実際のネイティブな形での2量体か、単なる両者のアグリゲーションか判断がつかないですが)、葉緑体のフォトンを受け取る光化学反応中心の構成たんぱく質D1とD2とかでしょうか。 両者30kDaくらいの膜たんぱく質で似た配列をしてます。光化学反応中は(たぶん)5つ位のことなるポリペプチドで成り立っていますが。そのなかでD1とD2は密に接触しています。 このコンプレックスを単りして、Laemlliの電気えいどうのシステムで流すと、30kDaにダブレット、60kDaあたりにばんどが得られ、前者はD1とD2がバラバラになったもの、後者は両者のコンプレックス(またはアクリゲーション)ということが、抗体などを用いて示されています。 あとは、コラーゲンや中間径フィラメントのコイルドコイルはなかなかはがれないと言われてますので、そういうものでなくても、タイトなコイルドコイルを形成しているタンパクがあっても不思議ではないですね。 なにかコバレントなインターラクションだったらすごく面白いかもしれません(そういう例は少ないでしょうかあるような気もしますが、、、)

SDS-PAGEで２量体 削除/引用 No.2372-1 - 2008/11/20 (木) 22:01:10 - あべちゃん いつも勉強させてもらっています。 SDS-PAGEに用いたサンプル、Laemlliバッファー（DTT入り）で変成させたサンプルが、なおも２量体を形成し続けるということは、あるんでしょうか？ もしあるとするならば、どのような蛋白質が知られているのでしょうか？ 免疫ブロットすると、あるストレス条件下のサンプルで必ず目的蛋白質の２倍程度の位置にバンドが現れ、タグ付きの目的蛋白質をタグ抗体で検出しても同様に観察されます。 経験談などお聞かせいただければと思います。よろしくお願いします。

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