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(無題) 削除/引用 No.237-14 - 2007/10/03 (水) 15:10:18 - DSC ご指摘ありがとうございます。 研究の内容にあまり触れたくなかったので「KO」という表現にしていましたが、厳密にはある種のKIで、ESの段階でKI(mutation)ベクターとCre発現ベクターをコトラしたものです。その後、組換えを確認できたESでキメラマウスを作製しました。 また、今調べているのはバッククロスの2-3代目なので、キメラである可能性は低いと思います。 ハサミからの（検出可能レベルの）コンタミの可能性は低いというご意見が多かったのですが、コンタミの原因については、まずはディスポカミソリ刃を試してみてから考えようと思っています。

(無題) 削除/引用 No.237-12 - 2007/10/03 (水) 14:10:23 - ats Creで飛ばした直後（Creマウスとの掛け合わせの子供）のマウスだと、体細胞がキメラになっている可能性がありますが、いかがでしょうか。もう一世代後なら、100%ですが。

ありがとうございました 削除/引用 No.237-10 - 2007/10/02 (火) 14:00:07 - DSC いろいろなご回答、ありがとうございました。 また、お礼が遅くなり申し訳ありません。 その後何度かPCRを行って確かめてみましたが、結局、DNAのサンプルが相互にコンタミしているのは間違いありませんでした。皆さんからのご意見だとハサミからのコンタミは考えられないという感じでしたが、他のどこでコンタミしているかは今のところわかりません。ただ、私たちのところではだいたい5Wくらいで尾をカットしているので、実際ハサミに結構な量の血液が付着することはたびたびあり、その時点が怪しいという考えは捨て切れません。これについては、尾の切り方やハサミの切れが悪いせいかもしれませんね。 ラットさんからご指摘を受けたとおり、PCRのサイクル数にも問題があったと思います。PCRの増えが今ひとつだったため、35サイクルかけていました。これは完全に飽和している状態だったので、もっと手前で終了すると、見たいバンドは頼りないにしてもコンタミによるバンド（？）は完全に検出されなくなりました。 このKOは、実際にはloxを挿入して作っているので、そこを挟むオリゴ対で34bpの差をPCRで検出するようにしています（例えばネガアレル500bp/ポジアレル534bpとか）。今のところ数種の組合わせのオリゴを使えるのですが、どの組合わせを使っても同じような結果です。当該の分子長以外のDNAはほとんど増幅されませんし、長さの違いもはっきり見分けられます。複数の個体をまとめて処理したときのDNAでは上記のように偽陽性バンドが出る一方、別の機会にコントロール（B6）から取ったDNAでは検出されないことから、オリゴには問題ないと考えています。 以上のような状況ですので、論文に載せる画像のために偽陽性を消すためにはとりあえずラットさんからのご指摘に従ってPCRのサイクル数を減らすことで対処します。 皆様、ありがとうございました。

ハサミはおそらく問題ではないでしょう 削除/引用 No.237-8 - 2007/09/29 (土) 10:40:54 - たいそん 完全にWTであることが明らかな（例えば新しく買ったB6とか）マウスのしっぽをきれいなハサミで切って、それでも薄くKOバンドがでる、もしくは水を鋳型に使用してもバンドがでるようならば、genotype PCRの条件（プライマーデザイン、温度設定）もしくはBuffer, dNTPなどのコンタミが問題でしょう。 毎週毎週１００匹近くしっぽを切っていたことがありますが、ハサミが原因と思われるDNAのcarry overは経験してません。3-4 wkで離乳する時にしっぽを切れば、それほどハサミも汚れないと思います。大人のマウスのしっぽを切りすぎるともちろん血が結構でますが。 また、ピペットを他の人のと交換したら、コンタミバンドが消えたという話は聞いたことがあります。。

(無題) 削除/引用 No.237-7 - 2007/09/29 (土) 00:46:30 - ラット どんなにコンタミしたって1/10,000以下でしょ。PCRを飽和まで廻さなきゃ１万倍の差は出せるでしょ。

(無題) 削除/引用 No.237-6 - 2007/09/29 (土) 00:08:00 - taka うちでは10以上のKO/TGマウスのgenotyping PCRを経験していますが、ハサミに付着した血液のコンタミでＰＣＲに影響を及ぼすような経験は一度もありません。一度に数十匹の3-5mmの尻尾を採取しますが、拭いたりしません。そもそもハサミに血液なんか付いたっけ？っていう感じです。他の過程でのコンタミやＰＣＲ条件（温度やプライマー設計）の問題を考えた方が良いのでは。

(無題) 削除/引用 No.237-5 - 2007/09/26 (水) 12:13:31 - t コンタミでは無くて、擬陽性のバンドがWT で元来出るのかもしれません。 PCRのアニール温度を１−3度Cあげて見てはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.237-4 - 2007/09/24 (月) 15:25:01 - M 私は一匹の尾を切ったあと、水道水を入れたファルコンチューブで洗う程度です。それが原因でコンタミしたことはないと思います。 昔はDSCさんと同じようにバンドの濃淡で判断せざるを得ないような結果が出ていましたが、プライマーの変更により完全に解消されました。 そもそもマウスの尾を切るときに血液が付着しない限り、洗うことさえ不要であると聞いたこともあるくらいなので、私は他の要因ではないかと思います。 アニーリング温度の調整やプライマーの新調は試されたのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.237-3 - 2007/09/23 (日) 21:06:18 - ats 一つの鋏で複数の尾1-2mmを切断し50mM NaOH 200uLで加熱・TrisHClで中和して、1uLをPCRに用いています。血液が鋏についたらアルコール綿で拭くくらいです。Sryでの雌雄判定および変異部位のPCR->制限酵素処理を行っていますが、擬陽性は出ていません。 PCRのnegative controlは問題ないでしょうか。primerやpipettemanのPCR産物での汚染などないでしょうか？

ディスポで 削除/引用 No.237-2 - 2007/09/23 (日) 11:41:28 - さとし カミソリ刃を使われてみては？割って使えば数匹／枚でコンタミせずにできます。 25-30円／枚ぐらいなので両刃を使えば3-4円／匹のコストで抑えられます。

相互コンタミさせずにマウス尾を切るには？ 削除/引用 No.237-1 - 2007/09/23 (日) 10:32:24 - DSC 何だかどんくさくてお恥ずかしい質問ですが。 KOマウスのバッククロスの際、マウス尾からDNA抽出してPCRでKOマウスを選別しています。 一度にだいたい4-6腹（30-40匹）の仔マウスの尾を切り解析しているのですが、PCR産物を電気泳動すると偽陽性の結果が多く出てきます。非組換えのマウスではKOに相当するバンドが「薄く」出るので実際のKOマウスと何となく区別はつくのですが、できれば明確な結果で判別したいと思っています。 そもそも、1本のハサミを使い回して尾を切っているのが原因だということは明らかです。1匹処理するごとに新しいエタノール綿で刃を拭き、さらに乾いたペーパータオルで拭いて次のマウスの処理に使っています。 少数のハサミで多数のマウスの尾を切断しておられる方がおられたら、どのようにして相互コンタミを避けていらっしゃいますか？　ハサミは5本ほどはありますが、オートクレーブや乾熱後に1匹ずつに使うには到底足りません。仔マウスの数も結構多いので、短時間でできる簡便な方法が望ましいです。 お知恵をお貸しください。

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