全3件 ( 1 〜 3 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2365-3 - 2008/11/24 (月) 14:49:02 - おお >[Re:1] ongoingさんは書きました : > ３．抽出したhistoneの定量はどうされていますでしょうか？Bradford assayで本当に良いでしょうか？Coomassie Blueがhistone proteinと反応しない（特にH1）という記載を見たことがあり、このためにBradfordでは測定できないということはないでしょうか？ 精製の度合いとかによりますが、280nmの吸収でもいいのでは、、

(無題) 削除/引用 No.2365-2 - 2008/11/20 (木) 18:02:47 - 怠け者 1.凍結臓器でいいのか、それとも新鮮なもでないとダメか？かということでしょうか？凍結臓器でも大丈夫ですが。臓器の場合は、まず核を分離してから酸抽出に持っていかないと純度とかの点で培養細胞のようにはうまくいかないと思います。 2. 特に水に溶かねばならない理由ががあるのでしょうか。そうでなければ8M 尿素とかSDS sample bufferとかならすぐ溶けます。そのあとｗesternとかならこれでいいと思います。あと蛋白質の一般的な方法として、ＴＣＡ沈殿したら通常はそのあとアセトンあるいは100%エタノール等で沈殿を洗って酸を除いてから適当な液に溶かします。クロマチン再構成実験を計画しているなら、いったん８ないし６Mの尿素に溶かしてから透析で尿素をゆっくり抜いていくという古典的な方法があります（たしかＮａＣｌ濃度もなんか重要とかおもったけど忘れた）。上手にやれば酸・有機溶媒変性ヒストンでもちゃんと再生するらしいです。詳細は覚えてませんが大学生のとき勉強したクロマチン（up biology シリーズ、東大出版会）という本に図入りで出てました。 酸抽出したヒストンを含む塩酸or 硫酸溶液と１０倍量以上の上記の有機溶媒とまぜて−２０Ｃに数時間ないし一晩置けばヒストンはちゃんと沈殿します。そのあと遠心して集めたものを適当なbufer/溶液で溶かせばTCAは必要ないです。 3. ブラッドフォールドよりも妨害物質が少ない点でBCA法が無難かなあと思います。（SDS OK ,尿素　OK　、でも還元剤は×）

組織からのヒストン抽出 削除/引用 No.2365-1 - 2008/11/20 (木) 05:04:13 - ongoing abcamのwebsiteにあるprotocol、Nature protocol vol2.No6.2007 1445〜のprotocolを参考にhistoneのacid extractionをしていますが疑問点について教えてください。 １．培養細胞でなくmouse組織から抽出する場合、最初のstepでのhomogenizeやextraction bufferを加えるまでの手順はどのようにされているでしょうか？ ２．TCA precipitationした後のpelletはddH2Oでなかなか溶けませんが、どのように工夫されているでしょうか？ ３．抽出したhistoneの定量はどうされていますでしょうか？Bradford assayで本当に良いでしょうか？Coomassie Blueがhistone proteinと反応しない（特にH1）という記載を見たことがあり、このためにBradfordでは測定できないということはないでしょうか？

全3件 ( 1 〜 3 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---