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(無題) 削除/引用 No.2362-25 - 2008/11/27 (木) 07:54:56 - 海外ポスドク ちょっと話がずれますが，Cの増加というのは，A,Bに比較し増加しているという意ですよね． Q-PCRのCt値でもって異なるPCR産物量の比較を実施するのは現状ではOKでしょうか？ もちろん，異なるプライマーペア間の増幅効率が同一であることが保証されればOKでしょうし，comparative Ctなどはターゲットとコントロールの増幅効率が同一であることを前提としていますからQ-PCRに使用するプライマーペアの多くは問題ないのだと思います． しかし，もしA,B,Cを検出するプライマーペア間で効率の確認をしていなかった場合に，Cのみ増幅効率が良くて「見かけ上1群のように発現が増加している（実際は1群のA,B,Cが同程度）」こともあり得るかもしれない点を危惧しました． 原核生物およびポリシストロンの話には門外漢なので，質問者さんの考える >何かup-regurationする機序があるのか、病原性に関与するタンパク質からのfeed back作用があるのか、遺伝子Cのみを増幅する別のmRNAがあるのか… という理由が充分起こりうる反応なのか否かが判断できないのですけれども，もしこれまでの報告から考えてこれらが机上の論の域を出ないものであれば，実験上のアーティファクトの可能性を疑ってみても良いと思っています（結果を否定するわけではありません，もし合理的な説明が困難だったらまずはという形で） もちろん，増幅効率の同一性が保証されており，過去の報告例から質問者さんの考える増加理由が充分あり得ると判断できる内容ならば何の問題もないのですけれども． あとCの増幅産物が単一であることの確認はなされました？ 以上，門外漢から

(無題) 削除/引用 No.2362-24 - 2008/11/26 (水) 21:30:31 - よっしー おおさんの指摘がありましたね．失礼しました．

(無題) 削除/引用 No.2362-23 - 2008/11/26 (水) 20:35:07 - よっしー Cの下流の遺伝子の転写開始点がCにあるとか．

(無題) 削除/引用 No.2362-22 - 2008/11/26 (水) 12:22:24 - ザンギ 面白い現象ですね。 独立した株での現象でしたら、いろんな可能性がありますね。 おおさんのおっしゃる独立したプロモーターもそうですし、アンチセンスRNA等による上流側の選択的な分解も考えられます。 ネガティブな見方をすれば、Cが増えてると思ってるのは実は逆鎖にコードされた別の遺伝子を見てる危険はないでしょうか？ 独りで研究してると議論する機会が限られるので、こういう場所を利用されるのはいいと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.2362-20 - 2008/11/21 (金) 06:16:07 - おお >[Re:19] バイ菌マンさんは書きました : > > ですが、依然としてCの発現が上がっている1群で何が起こっているのか、理由を説明できずにおります。 > Cの遺伝子の上流で(多分)Bの遺伝子の下流にほかの転写開始位置があるとも考えられますね。 もっとひらたくいえば、ポリシストロンのmRNAのほかにCだけのmRNAも合成されている可能性があるという考察は可能と思います。

(無題) 削除/引用 No.2362-19 - 2008/11/20 (木) 17:45:09 - バイ菌マン みなさま，丁寧なご返答頂き恐縮しております。 私が不勉強な点と、あまり細かい事はと思い抽象的な記述となり、意味の分からない質問になってしまいましたこと、重ねてお詫び申し上げます。まだ情報が不足していたり、正確にご説明できているか分かりませんが、研究の概要は以下のとおりです。 ある原核生物について、病原性を有する株とそうでない株があるのですが、その違いを調べました. 3つの遺伝子には突然変異があるものがあり、病原性と相関づけられました。また、発現をmRNAレベルでそれぞれの株について調べたところ、過去の文献に示された基準に基づいて 1 遺伝子C（3’付近にあります）の発現が増加している群 2 遺伝子Cの発現が平均的な群 3 遺伝子Cの発現が極端に減少している群 に分けることができました。ポリシストロニックな発現であるのに遺伝子Cの発現が変化する理由をReviewerに求められているという状況です。 発現が減少している3群は皆様の仰るように転写終結や転写速度の問題、mRNAの安定性などが考えられるかと思います。ご指導ありがとうございました。過去の文献や配列を調べて、Northernを行ってみます。 ですが、依然としてCの発現が上がっている1群で何が起こっているのか、理由を説明できずにおります。 何かup-regurationする機序があるのか、病原性に関与するタンパク質からのfeed back作用があるのか、遺伝子Cのみを増幅する別のmRNAがあるのか…私が考えているのはこのくらいでしたが、皆様の様々なご意見をお聞かせいただきとても勉強になりました。 周囲に専門家もおらず、ボスも専門外なのですが、皆様のご意見を参考に独学で考察してみます、 皆様、本当にどうもありがとうございました。 お世話になりました。

(無題) 削除/引用 No.2362-17 - 2008/11/20 (木) 01:36:10 - おお 一本のmRNAからということなので、原核生物かなと思いながら レスできないながらフォローしていたのですが、 そういうことだったんですね。 CがmRNAの3'末端にある時BとCの間に転写が終結する場合がある。 Cを含まないmRNAやCを含むmRNAができたりする。 PCRの領域が、なにか違う転写産物とオーバーラップしている。 データーベース(があるなら)BとCの間で終結している mRNAがあるかチェックする。 BとCに転写終結に関係するRNA配列があるかどうかちぇくする。 そのほかの可能性としては、mRNAがBとCの間できれる。 3'エンドからCが削られるがBとCの間でその分解がとまる。 いずれにしろ、ノーザンが一番スッキリしたデーター になるかと思います。 しかし、ポリシストロンなのに、発現が変化(違い)に たいして何の議論、データーも示さなかったのは ちょっと失敗ですね。

(無題) 削除/引用 No.2362-16 - 2008/11/20 (木) 00:51:02 - ノーザン ノーザンで調べればすぐわかることだと思いますよ。その転写が起こる条件で経時的にサンプル調製し、ABCそれぞれおよび全体をカバーできるプローブをかける。似たような現象はバクテリアではよくあるので過去の事例を調べて理由を見つけてください。皆さんがおっしゃているようなしくみです。

(無題) 削除/引用 No.2362-15 - 2008/11/20 (木) 00:35:44 - act 疾患のある原核生物？mtの遺伝子？ 遺伝子Cが、増えたのか減ったのかを書かないと、回答がし難いと思います（解釈がことなりますので）。

(無題) 削除/引用 No.2362-14 - 2008/11/20 (木) 00:13:17 - ~ なるほど。 ヒトなどの細胞で疾患に関連する遺伝子を解析をしていると思っていましたが、 病原菌？の疾患に関連する遺伝子についての解析で、だからHNがバイ菌マン さんなんですね。 ポリシストロニックなｍRNAの3箇所についてRT-PCRをしたら、 後ろの部分(c)の量はサンプル間で変動があり、 前半（A)、中間（B)ではサンプル間の差が見られなかったという結果が得られているのですね。 BとCの間で、転写の終結か、分解の抑制が起きていると予想できますね。

(無題) 削除/引用 No.2362-13 - 2008/11/20 (木) 00:09:11 - ami > スプライシングは起こりません 全てを説明できる考え方を伝授したら、論文に名前載せてくれるということであれば全部書きますが、どうですか？

(無題) 削除/引用 No.2362-12 - 2008/11/19 (水) 22:09:37 - 小姑 相変わらず何を仰ってるのかはっきりしませんね。 ポリシストロニックなmRNAからA、B、Cという３つのタンパク質が「翻訳」されるんでしょう？なのに「A,B,C遺伝子のmRNAに対応するプライマーをそれぞれ設計し」というのはおかしいですよ。 アテニュエーションが起こって転写が途中で終結してるんじゃないんですか？

(無題) 削除/引用 No.2362-11 - 2008/11/19 (水) 21:57:27 - ＮＦ 原核・・・。 mRNAが分解後にＣに対応する部分だけ安定してるのでは。それによって最終的なタンパク量が調整されているのでは。ＷＢしてみたら・・・。 バイ菌マン さんはどう考えているの？他人の答え待ち？

(無題) 削除/引用 No.2362-10 - 2008/11/19 (水) 21:41:28 - バイ菌マン 皆様方、ご回答ありがとうございます。とても勉強になりました。 タンパク質発現とmRNA発現を混同するようなニュアンスになっておりましたためにとても紛らわしく、大変申し訳ありませんでした。 検討しているのはmRNAレベルの発現です。 A,B,C遺伝子のmRNAに対応するプライマーをそれぞれ設計し、 RT-PCRを行ってそのmRNA発現量を比較したところ、一つだけ発現量が異なっていました。これらのmRNAは一本の長いmRNAから1つのプロモーターで複数の遺伝子が発現する、原核生物特有のポリシストロニック発現で遺伝子発現するものです。また、スプライシングは起こりません。 同じmRNAから生じるはずのこれらのmRNAの発現量が異なっている理由を考察しております。

(無題) 削除/引用 No.2362-9 - 2008/11/19 (水) 21:11:16 - genji 確認ですが、オルタナティブスプライシングが起きていて、mRNAレベルでは発現量が同じであるが、タンパク質レベルでは翻訳産物Cだけ差があるという理解でよろしいでしょうか。 転写後調節 翻訳調節 翻訳後調節 などが考えられますね。 Dnmt3bなんかはある状態でmRNAレベルの発現量は同じですが、条件を変えるとmRNAレベルでの発現量が同じなのにタンパク質レベルでは違うということもあります。 これはmRNA同士の相互作用によるものなのですが。。。 他の方に託します。。

(無題) 削除/引用 No.2362-8 - 2008/11/19 (水) 21:02:48 - ~ >A,B,Cの発現量をRT-PCRで調べましたが、結果、Cの発現量にだけ差 >それぞれのタンパク質発現量が異なること 発現量という用語をRNAとタンパク質の両方に使っていますね。 伝わりにくくなりますよ。 >一本のmRNAからのそれぞれのタンパク質発現量が異なることはあるのでしょうか。 知りたいのはタンパク質レベルなのですか？mRNAレベルなのですか？ タンパク質レベルについての質問であれば、すでに小姑さんがかかれていますよね。 おそらくA,B,Cはスプライシングバリアントであり、異なるmRNA,アミノ酸配列を持つのですよね？ 翻訳効率や安定性に違いがあってもおかしくないでしょう。 mRNAレベルであれば、素直に考えれば、 選択的スプライシングによるA,B,Cの生成量の違い 各mRNAの安定性の違い あたりではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2362-6 - 2008/11/19 (水) 20:59:15 - ＮＦ >>ひとつのmRNAからA,B,Cのタンパク質が生じる場合に、そのA,B,Cの発現量をRT-PCRで調べましたが、結果、Cの発現量にだけ差がありました。 タンパク質としての発現量とRNAとしての発現量がごっちゃになっている気がします。単にスプライシングの問題では？または開始コドン使用頻度が違うとか。基本的なとこだと思うのですが。直属の先輩や教授はなんの言っているのですか？相談しましたか？

お返事有難うございます． 削除/引用 No.2362-5 - 2008/11/19 (水) 20:31:47 - バイ菌マン 早速のお返事、ありがとうございます。 すみません、説明不足だったので補足させていただきます。 ひとつのmRNAからA,B,Cのタンパク質が生じる場合に、そのA,B,Cの発現量をRT-PCRで調べましたが、結果、Cの発現量にだけ差がありました。 同じmRNAから生じるのにCの発現量に差があるのはおかしいとの指摘を受けたのですが、一本のmRNAからのそれぞれのタンパク質発現量が異なることはあるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2362-4 - 2008/11/19 (水) 20:14:54 - ＮＦ ここで解答すれば、論文に名前を載せてくれますか？

(無題) 削除/引用 No.2362-2 - 2008/11/19 (水) 20:11:10 - 小姑 転写産物はRNAですよ。 それはさておき、mRNAが一定でタンパク質（翻訳産物）がまちまちなのは、 １）翻訳効率の違い ２）タンパク質の分解速度の違い のどちらかであることが考えられますが、どちらがどのくらい寄与しているかはタンパク質毎の事情であって、それに則してdiscussionできるならともかく、一般論を述べても意味があるとは思えません。

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