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(無題) 削除/引用 No.2355-6 - 2008/11/19 (水) 23:04:57 - AP ISHのブロッキングをいろいろためしていたときに気がついたのですが、ミルクカゼインはリン酸バッファー系だと溶けにくいんじゃないかと思います。 高濃度で溶かそうとすると溶け残りますし、溶けた液もなんとなく均一じゃなくてざらっとした感じに見え、顕微鏡で見ても溶け残った粒子で標本が汚れていたりしました。 PBSでなくTBSに変えるか、スキムミルクではなくBSAとか他のブロッキング剤にしたらどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2355-5 - 2008/11/19 (水) 22:26:04 - マカロン 皆様、いろいろとアドバイスいただき、ありがとうございます。 キットは新しいのを開けたばかりで、また、発色させる直前に溶液は調整しているので、過酸化水素は失活していないかと思います。アジ化ナトリウムは使っておりません。 そう考えていますと、浮いてくるのはメンブレンのクズではなく、スキムミルクのような気がしてきました。しかし、２次抗体処理後に、PBS等で洗いをする時や発色時に、浮遊物が見られました。これもスキムミルクの凝集物が残っていたのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2355-4 - 2008/11/19 (水) 10:52:05 - ~ 最終洗浄にもアジ化ナトリウム入りのバッファーを使って、HRPを阻害していませんか？ 発色はやったことがありませんが、発光でたまに間違えます。

(無題) 削除/引用 No.2355-3 - 2008/11/19 (水) 05:54:03 - JK 浮いてくるのは、メンブレンのクズですか？ 以前、あるメーカーのスキンミルクをブロッキングに使ってると、常温で浸透時にミルクが凝集し、その凝集の中に抗体がトラップされて全くバンドが出なくなりました。ミルクを別のメーカーに換えると解決しました。

(無題) 削除/引用 No.2355-2 - 2008/11/19 (水) 04:17:30 - おお HRPの検出系でこの手の問題で原因としてよくあるのは、 過酸化水素の失活ですね。

ウエスタンブロット　発色しません 削除/引用 No.2355-1 - 2008/11/18 (火) 22:15:45 - マカロン ウエスタンをやっているのですが、今まで何度も行って成功していたはずが、2度続けて発色しず、原因が分からないでいます。時間をおいてもバックグランドも発色していないですが、マーカー部分のみ切り取って、CBB染色すると綺麗に出てきますので、転写はされているかと思います。 サンプル自体は動物細胞で発現したタンパク質を用いており、全く同じサンプルではないですが、基本的に同じ目的で作製したものの発現確認をおこなっています。 染色は、コニカイムノステインキットで、HRP-過酸化水素を利用した青色に染色されるものです。 気になる点としては、�@1次抗体に自作のモノクローナル抗体を使っているのですが、凍結融解を繰り返してしまった点。�A洗いや染色時に気づいたのですが、PVDFメンブレンの細かいクズが沢山浮いているような気がします。そんなに強く振とうしてはいないと思うのですが、液に紙くずみたいなのがかなり浮いています。メンブレンが劣化しているのでしょうか？！ 特に�Aに関しては、これまで気になったことがなかったのですが・・。何かアドバイス等ありましたら、教えていただけると嬉しいです。お願い致します。

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