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(無題) 削除/引用 No.2345-3 - 2008/11/27 (木) 13:17:00 - mochi 通りすがり様、ご返答いただき、ありがとうございます（御礼が遅くなり、申し訳ありません）。 なるほど、そういった基準で篩い分けられているんですね。 勉強になりました。 今設計しているのはinternal control用のプライマーなのですが、どうしても目的のもの以外でXR、XM、NRがつくものがひっかかってしまいます。 メーカーから販売させているものも検索してみのですが、やはりNM以外のものもひっかかっていました。 参考にしたメーカーのはTaqman用でしたので、実際は蛍光プローブとの特異性も関係しますので問題はないのかもしれませんが、私はできればSYBRで検討したいと思っております。 そこで質問なのですが、プライマーの特異性の確認はどのように行われておりますでしょうか。 ちなみに私は設計時でのBlast検索→解離曲線解析→電気泳動で確認をしております。 しかしこれだけでは問題のXR、XM、NRがつくものはバンドの長さも同じなので識別ができない可能性がとても高いと思います。 この場合、シークエンシングをすればよいのでしょうか。 リアルタイムPCRをされている方はプライマーチェックの際、必ずシークエンシングにより配列を確認されているのでしょうか。 以上、ご教授の程、よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.2345-2 - 2008/11/19 (水) 20:09:16 - 通りすがり 以前聞いた話では、 ・1文字目が"N"のシリーズは、RefSeqスタッフによって検証された、ある程度信頼の置ける配列情報で、"X"のシリーズはそれ以外の配列情報 ・2文字目が"M"のシリーズはタンパク質をコードし得る領域があるが、"R"のシリーズにはない というようなことだったと思います。 (今調べてみましたら、 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/key.html#accessions に詳細が載っているようです。) よって"NR"のシリーズについては実在する可能性が非常に高く、RT-PCRで引っかかり得ると思います。 複数のprimer対の候補について同様に検討し、一番よさそうなものを選んでみてはいかがでしょうか。 なお実際の特異性については、実験的に確認されるのが一番よいかと思います。

accession numberのNMとXR、XM、NR 削除/引用 No.2345-1 - 2008/11/17 (月) 12:22:07 - mochi お世話になっております。 現在、リアルタイムRT-PCRのプライマー作製を行っています。 作製したプライマーをBlastなどにかけて特異性を確認したところ、目的の遺伝子(Accession numberがNM_XXXXXXと付くもの)以外にもmisc-RNA(Accession numberがXR_XXXXXXと付くもの)やhypothetical protein(Accession numberがXM_XXXXXXと付くもの)、pseudogene(Accession numberがNR_XXXXXXと付くもの)が引っかかってきました。 これらはいったい何でしょうか。 目的以外でAccession numberがNM_XXXXXXと付くものは他にはなかったのですが、このプライマーは特異性が高いと判断して反応に使用していいものなのでしょうか。 ご教授の程、よろしくお願い申し上げます。

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