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(無題) 削除/引用 No.2342-15 - 2008/11/19 (水) 12:39:51 - sin >おお様 ありがとうございます。 なるほど、いただけることもあるのですね。 いろいろな策が用意できて、とりあえず安心しました。

(無題) 削除/引用 No.2342-14 - 2008/11/18 (火) 14:59:48 - おお >[Re:11] sinさんは書きました : > >おお様 > わざわざありがとうございます。 > なかなか高度でカッコいい方法ですね。 > 勉強になりました。 > ただ、うちにはウェスタンを行う備品すらないので、実際に行うとなるとなかなか難しそうですが・・・。（材料化学研究室なのです） 結局バブリッシュされている研究室で、そのコンストラクト (プラスミド)がもらえるところがあれば 話が早いと思います。細胞に導入して、アポトーシスが起こる処理をして、 蛍光が論文と同じように変化するかを確認すればウエスタンまで掘り下げて 調べるのはそんなに必要があるとはおもえないです。

(無題) 削除/引用 No.2342-13 - 2008/11/18 (火) 10:06:48 - sin >EcoRI様 ありがとうございます。 いざとなったらあたって見ます。

(無題) 削除/引用 No.2342-12 - 2008/11/17 (月) 17:22:49 - EcoRI >ただ、うちにはウェスタンを行う備品すらないので、実際に行うとなるとなかなか難しそうですが・・・。（材料化学研究室なのです） 生化学、分子生物学系のラボに協力を打診してはいかがでしょう？ PAGE機器やブロッター程度なら、貸してくれるかもしれません。 もしかしたら、アポトーシスを扱っている医学系のラボでも？

(無題) 削除/引用 No.2342-11 - 2008/11/17 (月) 14:45:39 - sin >おお様 わざわざありがとうございます。 なかなか高度でカッコいい方法ですね。 勉強になりました。 ただ、うちにはウェスタンを行う備品すらないので、実際に行うとなるとなかなか難しそうですが・・・。（材料化学研究室なのです） とりあえずは欲を出さずに、極力今ある試薬で何とかしようと思います。

(無題) 削除/引用 No.2342-10 - 2008/11/17 (月) 13:41:25 - おお リポータータンパクをと言うのはだれかやっているだろうなと思ってましたが 結構新しいのが見つかりました。 Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Sep 16;105(37):13901-5. Epub 2008 Sep 8. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Bardet PL, Kolahgar G, Mynett A, Miguel-Aliaga I, Briscoe J, Meier P, Vincent JP. mRFP(赤の蛍光タンパク)とeGFP(緑)をカスペース3認識配列をはさんで融合して膜に止めておいて、カスペース活性により両者が分かれeGFPは核に移行するというものです。 この手の物はほかにも何種類かあるかもしれません。 こういうレポーターだと染色や色素の添加をしなくて良いので バックに悩まされることはないと思いますが、、

(無題) 削除/引用 No.2342-9 - 2008/11/17 (月) 13:03:16 - sin >おお様 ありがとうございます。 残念ながらコンフォーカルではない、落射型蛍光顕微鏡です。

(無題) 削除/引用 No.2342-8 - 2008/11/17 (月) 12:56:11 - おお 蛍光の観察はどんな顕微鏡を使ってますか? コンフォーカルだと、基盤の面より高い平面で蛍光が観察ができ ると思うのですが、、そうそると、基盤のシグナルを カットできないでしょうか、、、

(無題) 削除/引用 No.2342-7 - 2008/11/17 (月) 12:38:07 - sin >おお様 細かい理屈までは理解できていないのですが、活性型のcaspase3と7に、蛍光標識された阻害剤が結合する、とのことです。 モノは「SR-FLICA」です。 >~様 ありがとうございます。 アポトーシスが起きていることを証明するため、とりあえずSR-FLICAを用いてみた、という段階です。 高価なので、いよいよどうしようもなくなったら別のものを試してみようと考えています。

(無題) 削除/引用 No.2342-6 - 2008/11/17 (月) 12:28:40 - ~ Calcein-AM、FDA(Fluorescein diacetate)、CFSE、BCECF-AM などがアポトーシス検出に用いられていると思いますが、 全て同じ結果になるのでしょうか？ 目的はアポトーシスしている細胞を検出することだと思いますので、 基盤との相性のいいものを探すのも1つの手だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2342-5 - 2008/11/17 (月) 11:49:07 - おお >[Re:4] sinさんは書きました : > >おお様 > 私の研究では、基板の表面構造が細胞に与える影響を観測しています。 そうすると細胞死をモニタリングできるレポーターを細胞が持っていればいい とも思えますが、それなら何とかなるかも、、またアイデアがあればかきます。 その酵素阻害剤というのは、カスペースの基質でのアナログで、活性化した カスペースにより、蛍光を発するようになるヤツデはないでしょうか、、

(無題) 削除/引用 No.2342-4 - 2008/11/17 (月) 11:21:16 - sin >EcoRI様 なるほど・・・。そうですよね。 試薬が高価な上に不慣れで、なるべく近道しようと焦っておりました。 バックグラウンドの影響が低い基板で、ブロッキングの影響を見てみます。 ありがとうございます。 >おお様 私の研究では、基板の表面構造が細胞に与える影響を観測しています。 そのため、播種前に基板に細工をするのは難しいと思われます。 ただ、細胞を先に染色しておく、というのは可能なのかもしれません。 ありがとうございます。 とても参考になります。

(無題) 削除/引用 No.2342-3 - 2008/11/17 (月) 11:02:35 - おお 先にブロッキングしてから、培養できないですか、、、 たしか、基盤にリボソームとか張り付ける時に、観察時のバックグランドをさげるために、アミノ酸(たぶんリジン)でコートしたというのを聞いたことがあります。 実験の系がいまいち分からないのですが、その酵素阻害剤で処理しておいてから、細胞をまいて、アポトーシスというステップはふめますか?

(無題) 削除/引用 No.2342-2 - 2008/11/17 (月) 10:52:11 - EcoRI >（染色前にブロッキングを行うと、アポトーシスを含む不要な細胞死を招きそうな気がします） 一度、side by sideでやってみては損はないと思うのですが…

酵素阻害剤による細胞染色 削除/引用 No.2342-1 - 2008/11/17 (月) 10:46:26 - sin いつもお世話になっております。 現在、セラミックス基板上でアポトーシスを起こした細胞を、酵素阻害剤を用いて蛍光染色し、蛍光顕微鏡観察を行っております。 しかし一部の基板では、吸着性が非常に強いためバックグラウンドがきつく、細胞の発光の観察が困難な状況です。 抗体染色ですとブロッキングを行うところですが、この試薬の操作手順は 細胞を培養 ↓ 培養系に直接蛍光試薬を投入 ↓ 洗浄後観察 となっておりまして、ブロッキングを行うタイミングがないのです。 （染色前にブロッキングを行うと、アポトーシスを含む不要な細胞死を招きそうな気がします） そこで、もういっそのこと、抗体染色と同じ手順で染色を試みようと思っております。 細胞を培養 ↓ 固定化＆可溶化＆ブロッキング ↓ 染色＆観察 この方法では駄目だ、というご意見の方が居られましたら、ご指摘いただけると幸いです。 よろしくお願い致します。

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