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(無題) 削除/引用 No.2336-5 - 2008/11/17 (月) 13:51:35 - 名無し 100%完全に固定化できているとは限らないのでSDSなど強い条件だときちんと固定化できていなかったものは溶出してきます。

(無題) 削除/引用 No.2336-4 - 2008/11/16 (日) 21:12:13 - ムーミン IgGは２分子のＨ鎖と２分子のＬ鎖がS-S結合で結合したものなので、このうち１分子が固定されていてもサンプルバッファーで煮れば出てくるでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.2336-3 - 2008/11/16 (日) 14:56:56 - in situ TAPタグを用いた精製はやったことがないのですが、サンプルバッファーで溶出すると、アガロースビーズごと溶出されてきます。したがって、当然抗体も溶出されます。 サンプルバッファーで溶出するというプロトコルは何を参考にされたのでしょうか？ とりあえず、今調べてみたところ、下記のアドレスにTAPタグを用いた精製法が公開されているようです。 http://www-db.embl-heidelberg.de/jss/servlet/de.embl.bk.wwwTools.GroupLeftEMBL/ExternalInfo/seraphin/TAPpurification.html 参考にしてみてください。

(無題) 削除/引用 No.2336-2 - 2008/11/16 (日) 14:43:42 - とも FLAGタグを使ったらFLAGペプチドで溶出できます。この場合ウエスタンしたときにH鎖L鎖のバンドは見えません。 また、ウエスタンでH鎖L鎖が見えないだけで良いのであれば、2次抗体をH鎖、L鎖のみでは反応しないような抗体もあります。IPとウエスタンで使い抗体の種を変えてもいいのですが、場合によっては見えることがあります。

IPでの溶出について 削除/引用 No.2336-1 - 2008/11/15 (土) 22:34:25 - jk お世話になっております。免疫沈降（IP）でのビーズからの溶出ステップに ついての疑問です。現在、co-IP実験を行っていますが、沈降させる当該 タンパク質にはTAPタグがついておりますので、沈降はIgGがビーズに固定化 されたIgGセファロースを使用しています。通常は低pHにて溶出した場合、 固定化されているIgGのコンタミは最小限なのですが、SDS-PAGE用のサンプル バッファーで溶出するとかなりな量のIgGがビーズから溶出されてきます。 固定化されているならばSDSでも溶出されないはずだと思うのですが、SDSに よってセファロースビーズそのものがダメージをうけているのでしょうか？ 何故、固定化されている抗体が溶出されるのかがわかりません。 同じような実験をPierceのSeizeXキットを用い、GFP抗体をビーズに固定化した 所、やはり上記のIgGセファロースと同じく、サンプルバッファーによる溶出に よって大量のGFP抗体が溶出されてきました。この抗体の溶出を軽減する方法は 低pHによる溶出の他どのようなものがあるでしょうか。また、何故溶出されて くるのかアイデアを頂ければ幸いです。宜しくお願い致します。

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